钙黏蛋白表达与表皮生长因子受体分子靶向治疗敏感/耐药的相关性

邢荣春,郑军,刘伟,姚汝铖

(三峡大学第一临床医学院、湖北省宜昌市中心人民医院普通外科,宜昌 443003)

钙黏蛋白表达与表皮生长因子受体分子靶向治疗敏感/耐药的相关性

邢荣春,郑军,刘伟,姚汝铖

(三峡大学第一临床医学院、湖北省宜昌市中心人民医院普通外科,宜昌 443003)

目的 探讨钙黏蛋白表达与表皮生长因子受体(EGFR)分子靶向治疗敏感或耐药的相关性。方法乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-231)、膀胱癌细胞株(T24)、子宫颈鳞癌细胞(SiHa)、大细胞肺癌细胞株(H460)、肝癌细胞株(SK-HEP-1和MHCC97-H)以及单核细胞白血病(THP-1)等8种细胞分别用表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制药(EGFR-TKI)PD153035和吉非替尼处理48 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测其敏感或耐药性,计算各细胞的半数抑制浓度(IC50),并与各细胞钙黏蛋白水平比较,观察相关性。结果随着PD153035和吉非替尼浓度的升高,MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa细胞生存率明显下降,表现为敏感,钙黏蛋白表达阳性;H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1细胞生存率未见明显下降,表现为耐药,钙黏蛋白表达阴性。结论EGFR-TKI对上皮性肿瘤细胞的生存率与钙黏蛋白的表达水平存在相关性;钙黏蛋白可能在调节EGFR分子靶向治疗的敏感性方面起重要作用;钙黏蛋白作为标志物为临床筛选合适的患者进行EGFR-TKI分子靶向治疗提供了重要线索。

钙黏蛋白;表皮生长因子受体酪胺酸激酶抑制药;耐药;靶向治疗

随着对恶性肿瘤基础研究的不断深入,针对癌细胞异常通路和靶点的分子药物有着广阔的应用前景。目前,针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)分子靶向治疗已广泛应用于各类肿瘤的治疗,相对于传统化学治疗药物其已显现出独特的优势。在肿瘤的发生发展过程中,一个共同的分子过程是EGFR高表达或突变以后的异常活跃,不断将表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激的信号传入细胞内,导致细胞无限制增殖和癌变,最终发生局部浸润和远处转移。研究发现,肿瘤患者EGFR的过高表达与肿瘤的恶性程度、浸润转移情况、不良预后均有密切关系,是一个重要的分子靶点[1-2]。钙黏蛋白(E-cadherin)不仅参与了肿瘤组织浸润和转移,而且与EGFR分子靶向治疗敏感/耐药性关系密切,笔者主要探讨钙黏蛋白与EGFR分子靶向治疗敏感/耐药的相关性及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 本实验中乳腺癌细胞株(MCF-7和MDA-MB-231)、膀胱癌细胞株(T24)、子宫颈鳞癌细胞株(SiHa)、大细胞肺癌细胞株(H460)、肝癌细胞株(SKHEP-1和MHCC97-H)以及白血病单核细胞株(THP-1)等8种细胞均由三峡大学医学院分子生物学研究所惠赠。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 实验仪器 二氧化碳(CO2)恒温培养箱(MCO175175C型,日本SANYO公司)；倒置生物显微镜(XS2-D2型,重庆光学仪器厂)；电热恒温水浴锅(DK-S26型,上海精宏实验设备有限公司)；超净工作台(SW-CQ-IF型,上海玻璃仪器一厂)；自动平衡离心机(LDZ5-2型,北京医用离心机厂)；超低温冰箱(ELT-13V型,美国LANIS公司)；负压玻璃滤器(Germany公司)。

1.2.2 实验试剂 RPMI-1640培养液(GIBCO公司)；青霉素(华北制药股份有限公司)；链霉素(华北制药股份有限公司)；小牛血清(杭州四季青生物技术有限公司)；钙黏蛋白一抗鼠抗人单克隆抗体(Cell Sling公司)；钙黏蛋白二抗为羊抗鼠RAP抗体(武汉谷歌科技有限公司)；β-actin一抗为兔抗人抗体(武汉谷歌科技有限公司)；β-actin二抗为羊抗兔RAP抗体(武汉谷歌科技有限公司)；BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒(碧云天生物有限公司)；噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)试剂(武汉谷歌科技有限公司)；PD153035、吉非替尼(南京德宝生化器材有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT实验方法 检测细胞增殖抑制率时在96孔培养板上进行。制备单细胞悬液,调整细胞浓度至2× 105·mL-1。细胞悬液100μL加入96孔培养板,即每孔加2×104细胞,每组6孔。过夜后,翻板倒净培养液,加含不同浓度药物的培养液处理细胞,再将培养板放入CO2培养箱继续培养48 h。然后每孔加入MTT 20μL,于37℃培养2 h。翻板倒掉上清液,加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液100μL溶解。分光光度计测定吸光度(A值,波长570 nm)。细胞增殖生存率(%)=(实验组A值-本底A值)/对照组A值×100%。

1.3.2 Western-blot实验方法 提取蛋白并定量样本,将等量的蛋白样品(50μg)加入聚丙烯酰胺凝胶,常规电泳、转膜。用含5%脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)封闭硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,NC膜),室温60 min。加入1∶1 000稀释的一抗在4℃摇床上过夜。PBS洗4次。加入1∶5 000的二抗摇床上室温60 min。PBS洗4次。最后加入电化学发光底物反应5 min,暗室显影,β-actin为内参。

1.3.3 统计学方法 所有数据均用Excel表及SPSS13.0版软件包处理,然后进行统学分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 8种细胞经PD153035处理后的生存率 其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa细胞生存率随PD153035浓度升高而降低,表现为敏感；H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1细胞生存率随PD153035浓度升高而未见明显降低,表现为耐药。见图1。

图1 8种细胞经PD153035处理后的生存曲线Fig.1 Survival curve of eight kinds of cells treated by PD153035

2.2 8种细胞经吉非替尼处理后的生存率 其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa细胞生存率随吉非替尼浓度升高而降低,表现为敏感；H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1细胞生存率随吉非替尼浓度升高而未见明显降低,表现为耐药。见图2。

图2 8种细胞经吉非替尼处理后的生存曲线Fig.2 Survival curve of eight kinds of cells treated by gefitinib

2.3 PD153035和吉非替尼分别对8种细胞的IC50值分别比较上皮细胞与间质细胞的IC50,发现PD153035作用于MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa细胞的IC50值与作用于H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1的IC50值差异有统计学意义(P＜0.05)；吉非替尼作用于MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa细胞的IC50值与作用于H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1的IC50值之间差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。

表1 PD153035和吉非替尼分别对8种细胞的IC50值Tab.1 IC50of PD153035 and gefitinib on eight kinds of cells μmol·L-1

2.4 Western-blot结果 Western-blot检测结果显示: MCF-7、MDA-MB-231、T24、SiHa细胞中钙黏蛋白表达阳性；而H460、SK-HEP-1、MHCC97-H及THP-1细胞中蛋白表达阴性。见图3。

图3 8种细胞的W estern-blot检测结果Fig.3 Western-blot test results of eight kinds of cells

3 讨论

钙黏蛋白分布于人和动物的各类上皮细胞,在维持细胞的极性和完整性等方面起重要作用。钙黏蛋白的胞内部分高度保守,与连环素形成复合物,连接于肌动蛋白细胞骨架,由此得以形成和维持细胞与细胞的稳固连接和正常的组织结构[3]。钙黏蛋白是促进上皮细胞间相互黏附和维持组织结构稳定的重要蛋白,其表达受遗传控制、信号通路、锌指蛋白家族及miRNAs等的调节[4]。钙黏蛋白在介导细胞内信号转导和募集免疫应答细胞过程中起重要作用,其表达与肿瘤EGFR的分子靶向治疗敏感/耐药性关系密切。钙黏蛋白参与细胞间复杂的调控可能参与了EGFR-酪胺酸激酶抑制药(throsine kinase inhibitors,TKI)敏感或耐药的形成。笔者采用MTT测定EGFR-TKI (PD153035、吉非替尼)对细胞MCF-7、MDA-MB-231、T24、SiHa、H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1生存率的影响,其中MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa随药物浓度的升高细胞生存率下降明显,表现为敏感, H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1随药物浓度的升高细胞生存率未见明显下降,表现为耐药。

细胞上皮-间质转变(epithelial mesenchymal transition,EMT)是肿瘤组织浸润和转移的重要机制之一,其最重要的特征是上皮型钙黏蛋白表达的丢失,与本研究中上皮性癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、T24以及SiHa中钙黏蛋白表达阳性；而间质性肿瘤细胞H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1蛋白表达阴性的结果一致。钙黏蛋白表达下降或缺失,不仅与肿瘤的发生发展相关,而且还与肿瘤细胞的低分化、高侵袭性和转移性相关,同时还直接影响着患者的预后。钙黏蛋白主要功能是介导同型细胞间的黏附,因而参与胚胎发育、正常组织上皮细胞层的形成及维持其完整性和极性,具有抑制肿瘤细胞转移和侵袭的作用。

本研究显示PD153035和吉非替尼作用于癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、T24及SiHa,随药物浓度的升高细胞生存率下降明显,表现为敏感,钙黏蛋白表达阳性；癌细胞H460、SK-HEP-1、MHCC97-H以及THP-1随药物浓度的升高细胞生存率未见降明显下降,表现为耐药,钙黏蛋白表达阴性。说明钙黏蛋白表达与EGFR-TKI治疗肿瘤敏感/耐药性存在明显的相关性,并可能在其中发挥了重要作用。钙黏蛋白作为标志物为临床筛选合适的患者进行EGFR-TKI分子靶向治疗提供了重要线索。

EGFR和钙黏蛋白发生相互作用的空间基础是两者的亚细胞定位非常邻近,EGFR和钙黏蛋白共同存在于细胞间的黏附小带区。近年来,一些研究发现两者存在双向的作用关系[5]:在EGFR调节钙黏蛋白方面,钙黏蛋白的细胞质内区与β-连环蛋白(β-catenin)的核心区连接成复合物,再连接到肌动蛋白的细胞骨架上,以维持细胞间的紧密连接。β-catenin是EGFR作用的底物,当EGFR配体(如EGF、TGF-β等)与EGFR结合后,具有酪胺酸激酶活性的EGFR细胞质内区活化,引起钙黏蛋白与βcatenin复合物中的β-catenin磷酸化,导致β-catenin从复合体解离并使复合物从肌动蛋白解离开来,从而降低细胞间的黏附性。因此,配体与EGFR受体的结合能促使钙黏蛋白表达的下调和EMT的发生[6]。

钙黏蛋白是一个钙依赖的细胞膜表面黏附分子,当细胞环境从低钙向高钙环境变化时能激活钙黏蛋白的活化及EGFR的磷酸化[7-8]。此外,钙黏蛋白通过其细胞外的结构域和EGFR结合,还将减少后者的活性及与EGF结合的亲和力[9]。

研究发现,在钙黏蛋白突变的情况下,EGFR的磷酸化和受体内化显著增强[10]。但研究未提及钙黏蛋白的正常功能、缺少或突变对EGFR靶向治疗敏感性的影响。在EGF等生长因子的刺激下,EGFR受体内化的速度加快,同时也激活EGFR某些区域从而加速某些蛋白的降解。这些可能是机体内一种控制EGF信号强弱和持续性的机制,钙黏蛋白与EGFR互相调控的具体信号通路有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.009

Correlation of E-cadherin Expression and the Sensitivity to EGFR-TKI Molecular Targeted Therapy

XING Rong-chun,ZHENG Jun,LIU Wei,YAO Ru-cheng
(Department of General Surgery,the First Clinical Medicine College,Three Gorges University,Yichang 443003,China)

ObjectiveTo explore the correlation of E-cadherin expression and the sensitivity to EGFR-TKImolecular targeted therapy.MethodsEight kinds of cells,MCF-7,MDA-MB-231,T24,SiHa,H460,SK-HEP-1,MHCC97-H and THP-1 were treated with EGFR-TKIPD153035 and gefitinib,respectively,for 48 hours.The drug-sensitivity was detected by MTT,and theIC50of cellswere calculated.The E-cadherin protein were detected and compared.ResultsFollowed with PD153035 and gefitinib treatment,the survival rates of MCF-7,MDA-MB-231,T24 and SiHa significantly reduced,and more E-cadherin protein expressed.However,the survival rates of the H460,SK-HEP-1,MHCC97-H,and THP-1 cells showed opposite results.ConclusionThe sensitivity of epithelial cancer cells to EGFR-TKI is correlated with E-cadherin expression.E-cadherin may play a significant role on regulateing the sensitivity to EGFR-TKImolecular targeted therapy.E-cadherin is a key biomarker for recruiting appropriate patients for EGFR-TKImolecular targeted therapy.

E-cadherin;Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors;Resistance;Targeted therapy

R979.1;R965.1

A

1004-0781(2014)05-0582-04

2013-05-27

2013-10-10

邢荣春(1985-),男,湖北黄冈人,住院医师,硕士,专业方向:主要从事普通外科肿瘤研究。电话:(0) 13469870373,E-mail:xingrongchun@sina.com。

郑军(1965-),男,湖北宜昌人,主任医师,教授,研究方向:主要从事普通外科肿瘤研究。电话:(0) 15871598533,E-mail:zhengjun1995@163.com。