一测多评法测定锁阳中3种有效成分

杨瀚春,王荣,何家田,夏鹏霄,谢华

(1.解放军第513医院药剂科,甘肃东风 732750;2.兰州军区兰州总医院全军临床药理基地,兰州 730050;3.兰州大学药学院,兰州 730000;4.兰州军区药品仪器检验所,兰州 730050)

一测多评法测定锁阳中3种有效成分

杨瀚春1,王荣2,3,何家田4,夏鹏霄1,谢华2

(1.解放军第513医院药剂科,甘肃东风 732750;2.兰州军区兰州总医院全军临床药理基地,兰州 730050;3.兰州大学药学院,兰州 730000;4.兰州军区药品仪器检验所,兰州 730050)

目的 建立同时测定锁阳中儿茶素(CA)、没食子酸(GA)、原儿茶酸(PR)的高效液相色谱一测多评法。方法以锁阳中CA、GA、PR为考察指标,建立CA、GA、PR间的相对校正因子,并用校正因子计算CA、GA、PR的含量,将一测多评法的计算值与外标法实测值进行比较。结果建立了锁阳中3种成分的一测多评法;一测多评法的计算值与外标法实测值之间差异无统计学意义。结论同时测定锁阳中CA、GA、PR等3种成分的一测多评法方法可靠,结果准确,可用于控制锁阳药材及饮片的质量。

锁阳;儿茶素;没食子酸;原儿茶酸;一测多评法

锁阳亦称不老药,又名锈铁棒、地毛球、羊锁不拉,为锁阳科植物锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉质茎[1]。锁阳中含有的儿茶素(catechin,CA)具有提高免疫功能、抗氧化等活性,没食子酸(gallic acid,GA)具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用;原儿茶酸(protocatechic acid,PR)具有增加冠状动脉血流量、降低心肌耗氧量的作用,在体外具有明显抑制血小板聚集的活性和抗菌活性[2-3]。本实验采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定CA、GA、PR的含量,并利用以上3种成分内在的函数和比例关系,采用一测多评的方法[4-5],计算CA、GA、PR相互之间的相对校正因子(f)和3种成分的含量,为客观评价锁阳及其中成药的质量提供了新的分析模式。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 600高效液相色谱仪,Waters 996二极管矩阵检测器,Millennium32色谱工作站(美国Waters);十万分之一电子天平(Metter AE240型);超声波提取器(SK5200H,上海科导超声仪器有限公司);离心机(Anke TGL-16B,上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药 CA对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110877-200001)、GA对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110831-200302)、PR对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110809-200503),均供含量测定用,纯度均≥98%;乙腈为色谱纯(天津四友);水为灭菌注射用水;其余试剂均为分析纯。锁阳药材及饮片来源:东风场区(饮片)由杨瀚春采挖并切制,东风场区药材由夏鹏霄采挖,甘肃金塔药材由当采挖,内蒙古古日乃和内蒙古额济纳旗药材由当地采挖,乌鲁木齐(饮片)购自当地药店,兰州(饮片)取自兰州军区决医院药房。均由兰州大学药学院马志钢教授鉴定为Cynomorium songaricum Rupr.。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Hypersil ODS C18柱(4.6 mm× 250 mm,2.5 μm);流动相:乙腈∶水∶36%乙酸(8∶92∶0.1);流速:1.0 mL·min-1;检测波长为258.7 nm;柱温:室温;进样量:20 μL。理论板数按CA峰计算应不低于2 000。

2.2 对照品溶液的制备 取CA、GA、PR对照品适量精密称定,置于同一个10 mL量瓶中,加灭菌注射用水适量,超声10 min,加水至刻度,配制成含CA 0.118 mg·mL-1、GA0.126mg·mL-1、PR 0.147 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取锁阳粉末[过筛孔内径0.425 mm(40目)筛)]约1.0 g,精密称定,置50 mL量瓶,精密加入灭菌注射用水20 mL,称定质量,超声处理30 min,放冷,再称定质量,离心,上清液用微孔滤膜(孔径0.45 μm)滤过,置棕色瓶中,即得。取对照品溶液与供试品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,测定。结果见图1。

2.4 线性关系考察 精密吸取上述混合对照品溶液0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 mL,分别置5 mL量瓶中,加水稀释至刻度,依次取稀释后的混合对照品溶液及未稀释的混合对照品溶液各20 μL进样,按上述色谱条件测定,以对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线并回归处理。结果表明, CA在0.047 2～1.510 0 μg范围内、GA在0.050 4～1.610 0 μg范围内、PR在0.058 8～1.880 0 μg范围内线性关系良好。回归方程:儿茶素Y=82 466.81X+ 281.83,r=0.999 9、没食子酸Y=886 294.46X+ 1 485.33,r=0.999 6,原儿茶酸Y=2 136 116.67X+ 5 884.29,r=0.999 8。

图1 对照品(A)与样品(B)HPLC色谱图

2.5 精密度实验 取同一混合对照品溶液重复进样6次(每次20 μL),样品峰面积积分值的日内RSD分别CA 3.67%、GA 3.47%、PR 2.19%;日间RSD分别为CA 4.24%、GA 3.89%、PR 3.08%。

2.6 稳定性实验 精密吸取同一样品溶液,在24 h内按拟定的时间间隔重复进样8次,每次进样20 μL,样品中3种成分的平均含量分别为CA 4.176 8 mg·g-1, RSD为4.84%;GA 0.672 1 mg·g-1,RSD为4.10%;PR 0.131 5 mg·g-1,RSD为4.32%。

2.7 重复性实验 取同一批样品(甘肃金塔)6份,精密称定,分别按“2.3”项供试品溶液制备方法制备成6份样品液,进样,分析,结果平均含量CA为4.174 0 mg·g-1, RSD为4.18%;GA为0.672 1 mg·g-1,RSD为3.99%;PR为0.131 2 mg·g-1,RSD为4.14%。说明本法的重复性较好。

2.8 加样回收率实验 取已测定含量的锁阳样品(甘肃金塔)6份精密称定,分别加入相应量的对照品,按“2.3”项供试品溶液制备方法操作,进样20 μL,测得CA的平均回收率为100.6%,RSD为3.35%;GA的平均回收率为101.2%,RSD为2.36%;PR的平均回收率为97.90%,RSD为3.14%。

2.9 相对校正因子的计算 分别以CA、GA、PR为内参物,根据相对校正因子计算公式[4],分别计算各待评价成分与内参物的相对校正因子,见表1～3。

2.10 色谱峰定位 “一测多评”法色谱峰的准确定位一般可以采用保留时间差或相对保留值等参数结合色谱图整体特征,以及每个峰的紫外吸收特征来定位其余待测成分(a,b,…,i,…)色谱峰[6]。相对保留值指各待测成分与内参物s间保留时间的比值,计算公式:ras=tRa/tRs;保留时间差指各待测成分与内参物S间保留时间的差值,计算公式:ΔtRas=tRa-tRs。

表1 以CA为内参物的相对校正因子计算结果(n=2)

表2 以GA为内参物的相对校正因子计算结果(n=2)

表3 以PR为内参物的相对校正因子计算结果(n=2)

本研究分别考察相对保留值和保留时间差的重复性。结果表明保留时间差有一定的波动,RSD介于3%～4%;相对保留值的波动相对较小,RSD＜1%,因此采用相对保留值进行锁阳中CA、GA、PR等成分色谱峰的定位较为可行。见表4～6。

表4 以CA为内参物的相对保留值(n=2)

表5 以GA为内参物的相对保留值(n=2)

2.11 样品测定 分别取各批药材制备供试品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各20 μL,高效液相色谱仪进样测定。分别采用外标法和“一测多评”法计算锁阳中CA、GA、PR的含量,结果见表7～9。采用“一测多评”法及外标法所测得的锁阳中CA、GA、PR的含量基本一致,表明“一测多评”法可用于锁阳药材中CA、GA、PR的含量测定。

表6 以PR为内参物的相对保留值(n=2)

3 讨论

由表1～6可见,以不同的进样量测得的3种成分间的相对校正因子和相对保留值变异不大;由表7～9可见,“一测多评”法与外标法测得的结果非常接近,表明“一测多评”法可以用于中药多种成分的质量控制。由表9可以看出,由于药材中PR和CA的含量相差较大,并且PR和CA回归方程的截距相差较大,致使以PR为内参物计算样品含量时,药材中以外标法和QAMS法测定的CA含量的相对偏差偏大。因此,在实验中应进一步提高实验精度,使多个回归方程的截距相近。

表7 以CA为内参物计算样品含量(n=2) mg·g-1

表8 以GA为内参物计算样品含量(n=2) mg·g-1

表9 以PR为内参物计算样品含量(n=2)

以CA、GA、PR等3种成分分别为内标计算相互间的相对校正因子和相对保留值,能够更好地体现“一测多评”法的优势,即只要得到这3种对照品中的任何一种,就可以同时测定这3种成分的含量。

[1] 江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海人民出版社,1997:2395.

[2] 陶晶,屠鹏飞,徐文豪,等.锁阳茎的化学成分及其药理活性研究[J].中国中药杂志,1999,24(5):36-38,62.

[3] 张遵义.原儿茶酸衍生物的化学结构与冠脉流量、心肌耗氧量关系的探讨[J].药学学报,1980,15(11):641-643.

[4] 王智民,高慧敏,付雪涛,等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J].中国中药杂志,2006,31(23): 1925-1928.

[5] 尹萌,孟月兰,闻琍毓.关黄柏中生物碱类成分的“一测多评”[J].中草药,2011,42(6):1093-1096.

[6] 王智民,钱中直,张启伟,等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志,2011,36(6):657-658.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.032

R286;R927.1

A

1004-0781(2014)07-0952-04

2013-06-07

2013-07-22

杨瀚春(1970-),男,甘肃金塔人,副主任药师,学士,主要从事医院药学工作。电话:0937-2461618,E-mail: yhanchun@163.com。