雷公藤甲素对胰腺癌干细胞的影响

盛健，吴峰，夏甘霖，罗力，刘光华，潘华锋，吴远志，王旭

(武钢第二职工医院外科，武汉 430085)

雷公藤甲素对胰腺癌干细胞的影响

盛健，吴峰，夏甘霖，罗力，刘光华，潘华锋，吴远志，王旭

(武钢第二职工医院外科，武汉 430085)

目的 探讨雷公藤甲素(TPL)对胰腺癌干细胞的影响。方法利用不同浓度TPL处理人胰腺癌细胞PANC-1,流式细胞术检测胰腺癌干细胞相关分子CD44、CD24、ESA、CD133及ALDH1表达,流式分选表型的PANC-1细胞作为干细胞,再分别通过体外细胞球体形成实验及NOD/SCID小鼠体内移植瘤成瘤实验,验证TPL对胰腺癌干细胞成球及成瘤能力的影响。结果10,25 nmol·L-1TPL可抑制PANC-1细胞表面CD44、CD24、CD133及ALDH1表达,并可以抑制胰腺癌干细胞成球能力[对照组成球(30±4)个,5 nmol·L-1TPL组(13±2)个,10 nmol·L-1TPL组(5±1)个,P＜0.01]及成瘤能力(抑瘤率76.5%)。结论TPL能够抑制胰腺癌干细胞功能,可能是其抑制胰腺癌的机制之一。

雷公藤甲素；癌,胰腺；干细胞

胰腺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤,目前发病率呈上升趋势。因胰腺癌早期诊断困难,手术风险高而效果较差,也缺乏有效的化学治疗(化疗)药物,且对放射治疗(放疗)不敏感,在消化系统肿瘤中预后最差,总体五年生存率不足5%[1]。肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是一类具有自我更新与增殖分化潜能的细胞,在特定条件下可以形成不同分化程度的肿瘤细胞,被认为在肿瘤发生发展、耐药、转移与复发中发挥重要作用[2-3]。胰腺癌干细胞近年来成为研究的热点,目前研究表明,表型的胰腺癌细胞可能具有干细胞特性,而CD133、乙醛脱氢酶1 (Aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)等也可作为富集胰腺癌干细胞的标志[3-5]。雷公藤甲素(triptolide, TPL)是从卫矛科植物雷公藤中提取出的一种活性物质,是雷公藤的主要有效成分,在体内化学性质稳定。近年来研究发现,TPL具有明显的抑制胰腺癌细胞增殖,诱导胰腺癌细胞凋亡的作用,也可显著增强胰腺癌细胞对放疗和化疗的敏感性[6-8]。但TPL是否可以影响胰腺癌干细胞的数量及功能,目前尚不清楚。笔者在本实验中拟通过TPL干预人胰腺癌细胞PANC-1,探讨TPL对胰腺癌干细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞 人胰腺癌细胞PANC-1由本医院实验室传代所得,培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置于37℃、5%二氧化碳温箱内。

1.2 主要试剂 抗CD44、CD24、ESA及ALDH1抗体均购自美国BD公司(货号依次为559942,555428, 347197,611195),CD133购自德国美天旎公司(货号: 130-080-801)。实验动物非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠,雌性,8周龄,体质量20～24 g,购自武汉大学动物实验中心,实验动物许可证号: SCXK(鄂)2008-0004,置于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级动物中心饲养。

1.3 流式细胞术检测 将对数生长期的PANC-1细胞接种于6孔板,细胞融合度达到50%～60%时改用无血清培养基孵育24 h后,按梯度每孔加入不同浓度(10或25 nmol·L-1)TPL,对照组加入等量二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。24 h后收集细胞,磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)洗涤两次,分别标记CD44、CD24、ESA、CD133及ALDH1,利用FACSCalibur检测并分析。

1.4 体外细胞球体形成实验 利用CD44、CD24、ESA 3种抗体流式分选表型的PANC-1细胞作为干细胞,以每孔1 000个的密度接种于含有干细胞培养液[含10 ng·mL-1成纤维细胞生长因子、20 ng·mL-1表皮生长因子、5 μg·mL-1胰岛素、2.75 mg·mL-1转铁蛋白及2.75 μg·mL-1硒(ITS)]的超低吸附24孔板(康宁)中,每孔给予不同浓度TPL,培养14 d,普通光学显微镜下计数克隆形成个数。

1.5 NOD/SCID小鼠体内移植瘤成瘤实验 将上述分选所得干细胞计数,以每只5×103个接种于NOD/SCID小鼠右腹部皮下,15 d后均出现肉眼可见的皮下移植瘤,利用游标卡尺测定瘤体大小,计算体积,挑选12只瘤体体积和体质量接近的小鼠,随机分为两组,每组6只,实验组给予0.25 mg·kg-1·d-1TPL,皮下肿瘤周围注射给药,连续给药15 d;对照组给予含等量DMSO的0.9%氯化钠溶液。每隔3 d测量移植瘤体积1次并记录。第15天停药,第16天处死裸鼠,仔细剥离瘤块并称质量,按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率(%)=(对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%。

2 结果

2.1 TPL可降低PANC-1细胞中胰腺癌干细胞标志的表达 PANC-1细胞在TPL(10或25 nmol·L-1)或等量DMSO作用24 h后,分别标记CD44、CD24、ESA、 CD133及ALDH1抗体,流式细胞术检测及ALDH1的表达,结果见表1。TPL可降低PANC-1细胞中及ALDH1+表达,且差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。但TPL对ESA的表达没有显著性影响。

3 讨论

肿瘤干细胞理论于1997年提出,BONNET等[2]从人急性髓性细胞白血病患者中发现并成功分离出肿瘤干细胞。相对于血液系统肿瘤,实体瘤中的干细胞较难分离及研究。2003年,AL-HAJJ等首次从人类乳腺肿瘤中分离出一群细胞,并通过将该种细胞接种至NOD/SCID小鼠身上,发现100个细胞就可以100%成瘤,从而为实体瘤干细胞研究打开了局面[9]。LI等[4]于2007年在胰腺癌中筛选出细胞,并发现这群细胞具有自我更新、多向分化潜能及极强的成瘤能力,从而把CD44、CD24及ESA 3个指标作为分选富集胰腺癌干细胞的重要标志。随着研究的深入,其他一些细胞表面蛋白如CD133、ALDH1等也被认为与胰腺癌干细胞相关,并且发现利用不同表面分子分选的干细胞群之间有一定的交集,从而为人们理解干细胞的定义和功能提供了新的方向[3,5]。

表1 TPL可降低PANC-1细胞中胰腺癌干细胞标志表达情况Tab.1 Expression decline of pancreatic cancer stem cell markers in PANC-1 cells at the presence of TPL %

目前人们认为肿瘤干细胞与肿瘤的发生发展关系密切,尤其在恶性肿瘤化疗耐药复发等进程中发挥重要作用[3,10]。TPL作为祖国传统中药雷公藤的主要活性成分,研究表明对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用,能够明显抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭[11]。既往研究也发现TPL对胰腺癌细胞具有阻断细胞周期、抗细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,TPL同时还可以增加胰腺癌对放疗或化疗的敏感性[8,12],但TPL抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的具体机制尚不清楚。

笔者在本实验中通过流式细胞学检测发现,TPL可以降低PANC-1细胞中某些与胰腺癌干细胞相关的表达,提示TPL可能通过干预胰腺癌干细胞从而发挥抑制胰腺癌的作用。进而,笔者利用作为标志流式分选富集PANC-1中的胰腺癌干细胞,并通过体外细胞球体形成实验及体内移植瘤成瘤实验进一步验证了TPL对于胰腺癌干细胞的成球及成瘤能力具有明显的抑制作用,从而为TPL应用于临床胰腺癌的治疗提供了一定的理论基础。而且笔者发现TPL对于PANC-1细胞中的Wnt/β-catenin信号通路有一定的影响(结果未列出),而既往研究表明Wnt/β-catenin在维持干细胞干性的过程中发挥重要作用[13]。TPL是否通过Wnt/β-catenin调节胰腺癌干细胞的功能,有待进一步研究。

[1] HIDALGO M.Pancreatic cancer[J].N Engl J Med,2010, 362(17):1605-1617.

[2] BONNET D,DICK J E.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nat Med,1997,3(7):730-737.

[3] HERMANN P C,HUBER S L,HERRLER T,et al.Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer[J].Cell Stem Cell,2007,1(3):313-323.

[4] LI C,HEIDT D G,DALERBA P,et al.Identification of pancreatic cancer stem cells[J].Cancer Res,2007,67(3): 1030-1037.

[5] JIMENO A,FELDMANN G,SUAREZ-GAUTHIER A,et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development[J].Mol Cancer Ther,2009,8(2):310-314.

[6] YANG S,CHEN J,GUO Z,et al.Triptolide inhibits the growth and metastasis of solid tumors[J].Mol Cancer T-her,2003,2(1):65-72.

[7] WANG W,YANG S,SU Y,et al.Enhanced antitumor effect of combined triptolide and ionizing radiation[J].Clin Cancer Res,2007,13(16):4891-4899.

[8] 徐秀利,李新丰,王伟.雷公藤甲素抑制胰腺癌的研究进展[J].医学综述,2011,17(7):996-998.

[9] AL-HAJJ M,WICHA M S,BENITO-HERNANDEZ A,et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells [J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

[10] TRUMPP A,WIESTLER O D.Mechanisms of disease:cancer stem cells——targeting the evil twin[J].Nat Clin Pract Oncol,2008,5(6):337-347.

[11] 董志华.雷公藤甲素的抗肿瘤活性研究[J].实用临床医药杂志,2011,15(1):36-38.

[12] 吴深宝,周国雄,张弘,等.雷公藤内酯醇降调胰腺癌细胞5-脂氧合酶表达作用研究[J].医药导报,2007,26 (5):454-456.

[13] ESPADA J,CALVO M B,DIAZ-PRADO S,et al.Wnt signalling and cancer stem cells[J].Clin Transl Oncol,2009, 11(7):411-427.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.011

Effect of Triptolide on Pancreatic Cancer Stem Cells

SHENG Jian,WU Feng,XIA Gan-lin,LUO Li,LIU Guang-hua,PAN Hua-feng,WU Yuan-zhi,WANG Xu
(Department of Surgery,the Second Worker Hospital of Wuhan Iron and Steel Company,Wuhan 430085,China)

Objective To investigate the effect of triptolide on pancreatic cancer stem cells.MethodsHuman pancreatic cancer cells PANC-1 were treated with different doses of triptolide.Pancreatic cancer stem cell markers including CD44, CD24,ESA,CD133 and ALDH1 were measured by flow cytometry.ESA+PANC-1cells were sorted as pancreatic cancer stem cells.Cell spheres formationin vitroand xenografts tansplantation in NOD/SCID mice were tested to detect the effect of triptolide on pancreatic cancer stem cells.ResultsTriptolide reduced the expression of CD44,CD24,CD133 and ALDH1 in PANC-1,significantly inhibitted the ability of spheres formation(counts of spheres:30±4 in the control,13±2 in TPL at 5 nmol ·L-1and(5±1)in TPL at 10 nmol·L-1,P＜0.01),and reduced xenografts formation by 76.5%.ConclusionTriptolide could restrain the function of pancreatic cancer stem cells,which may account for the inhibition effect of triptolide on pancreatic carcinoma.

Triptolide;Pancreatic carcinoma;Cancer stem cell

R735.9;R965

A

1004-0781(2014)03-0315-03

2013-06-01

2013-07-12

盛健(1977-),男,湖北武汉人,主治医师,研究方向:胃肠道肿瘤。E-mail：66353327@qq.com。

王旭(1965-),男,河北石家庄人,主任医师,硕士,研究方向:胃肠道肿瘤。E-mail：zhaohmwx@163.com。