高效液相色谱切换波长法同时测定牛蒡子中活性成分的含量*

孙艳涛，赵兰英，李婷婷，赵磊，姜大雨

(1.吉林师范大学化学学院，四平 136000；2.吉林师范大学环境友好材料制备与应用省部共建教育部重点实验室，四平 136000；3.吉林省四平市食品药品检验所，四平 136000)

高效液相色谱切换波长法同时测定牛蒡子中活性成分的含量*

孙艳涛1，2，赵兰英1，李婷婷1，赵磊3，姜大雨1，2

(1.吉林师范大学化学学院，四平 136000；2.吉林师范大学环境友好材料制备与应用省部共建教育部重点实验室，四平 136000；3.吉林省四平市食品药品检验所，四平 136000)

目的 建立高效液相色谱(HPLC)切换波长法同时测定牛蒡子中3种活性成分含量。方法应用TC-C18色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm);流动相为甲醇-0.4%冰醋酸,梯度洗脱;流速1.0 mL·m in-1;检测波长为280与326 nm切换;进样量10μL;温度25℃。结果绿原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元分别在0.027 3～5.460 0,0.150 0～18.000 0和0.030 3～6.060 0μg范围内呈良好线性,线性方程分别为Y=1 106.476X-11.452,Y=1 026.014X+20.391和Y= 287.661X+4.045;平均加样回收率分别为99.55%,99.42%和99.40%。结论该方法快速、准确、重复性好,可用于牛蒡子中多组分含量的同时测定及质量控制。

牛蒡子；绿原酸；牛蒡子苷；牛蒡子苷元

牛蒡子来源于菊科两年生草本植物牛蒡子属牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果实［1］,为常用中药,有疏风散热、解毒透疹、利咽消肿等功效,现代药理学研究表明牛蒡子有抗病毒、抗炎、抗癌、抑制热休克反应等广泛的药理活性［2］。为建立高效液相色谱(HPLC)切换波长同时测定牛蒡子中3种活性成分含量,笔者首次利用切换波长法同时测定牛蒡子提取物中牛蒡子苷、牛蒡子苷元和绿原酸的含量,可为其质量控制提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；GWA-UN4系列超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；FA1104N万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；SK5200H超声波清洗器(上海科导仪器有限公司)。

1.2 试药 牛蒡子苷对照品(上海同田生物技术有限公司,批号:12042835,含量:98.0%)；牛蒡子苷元对照品(上海同田生物技术有限公司,批号:12050336,含量:97.0%)；绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110753-200413,含量:96.6%)；牛蒡子药材［来源:吉林省公主岭市,经吉林省四平市食品药品检验所中药室鉴定为菊科植物牛蒡子属牛蒡(Arctium lappaL.)的干燥成熟果实］；甲醇为色谱纯；冰醋酸为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取绿原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元对照品,置10 mL量瓶中,加入适量甲醇溶解,并稀释至刻度,即得浓度为273,1 500和303μg·mL-1的混合对照品溶液［3］。

2.2 供试品溶液的配制 按照《中华人民共和国药典2010年版一部》第66页中对于牛蒡子中牛蒡苷含量的测定方法进行样品的处理:牛蒡子粉末(过孔径0.300 mm药筛)0.5 g,精密称定,置于50 mL量瓶中；加甲醇约45 mL,超声处理20 min,加甲醇稀释刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得［4］。

2.3 色谱条件 色谱柱:TC-C18(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流动相:A为甲醇,B为0.4%冰醋酸,梯度洗脱(0～25 min:40%～70%A；25～35 min:70%～40% A；35～40 min:40%～40%A)；流速:1.0 m L·min-1；检测器:VWD检测器；检测波长:0～3 min,280 nm；3～6 min,326 nm；6～40 min,280 nm；柱温:25℃；进样量:10μL。

2.4 色谱图 按照”2.3”项色谱条件分别取一定浓度绿原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元混合液和供试品溶液进样。见图1,2。

图1 混合对照品溶液HPLC色谱图1.绿原酸;2.牛蒡子苷;3.牛蒡子苷元Fig.1 HPLC chromatogram of the m ixed reference solution1.chlorogenic acid;2.arctiin;3.arctigenin

2.5 标准曲线的绘制 精密吸取“2.1”项条件下配制的对照品混合溶液,以0.1,0.5,1.0,3.0,5.0,7.0, 9.0和12.0μL为进样量进样,按照“2.3”项色谱条件测定峰面积。以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,实验结果表明,3种活性成分的量均与峰面积呈良好的线性关系［5］,结果见表1。

图2 供试品溶液HPLC色谱图1.绿原酸;2.牛蒡子苷;3.牛蒡子苷元Fig.2 HPLC chromatogram of the test solution1.chlorogenic acid;2.arctiin;3.arctigenin

表1 3种活性成分的线性关系方程Tab.1 Linear equation of 3 kinds of active ingredients

2.6 精密度实验 精密吸取按照“2.2”项条件配制的一份样品溶液,连续进样五次进行测定,根据峰面积计算［6］。结果绿原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的RSD分别为0.4%,0.2%和0.4%,表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验 取药材0.5 g,精密称定,按“2.2”项下方法制备［6］,按上述色谱条件每隔4 h进行测定,共计进样6次,测定其稳定性。统计结果表明,绿原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元峰面积(A)的RSD分别为1.1%, 0.8%,1.3%,表明药材溶液在20 h内稳定。

2.8 重复性实验 按照“2.2”项条件配制平行样品溶液5份,进行含量测定。结果绿原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的RSD分别为0.4%,0.2%和0.3%,表明方法重复性良好［7］。

2.9 加样回收率实验 取牛蒡子药材粉末约0.1 g,共6份,精密称定,分别置于具塞锥形瓶中,分别加入含绿原酸0.270 mg·mL-1,牛蒡子苷5.000mg·mL-1,牛蒡子苷元0.420 mg·mL-1的混合溶液(0.1,0.1,0.2,0.2, 0.3,0.3 mL),按照“2.2”项条件配制成样品溶液,进行测定,并计算回收率。绿原酸的回收率为99.55%,牛蒡子苷的回收率为99.40%,牛蒡子苷元的回收率为99.42%,RSD均为0.3%。见表2。结果表明该方法具有良好的回收率。

2.10 样品含量测定 按照“2.2”项条件配制平行样品溶液5份,进行测含量测定。结果牛蒡子药材中绿原酸、牛蒡子苷和牛蒡子苷元的平均含量分别为0.203,6.241和0.409 mg·g-1。

表2 3种活性成分加样回收率实验结果Tab.2 Recovery results of 3 kinds of active ingred ients

3 讨论

3.1 检测波长的选择 利用紫外分光光度计对绿原酸、牛蒡苷和苷元进行光度扫描,发现绿原酸在326 nm处有最大紫外吸收,而牛蒡子苷和牛蒡子苷元在280 nm处有最大紫外吸收,故含量测定时分别采用最大吸收波长为检测波长。

3.2 流动相的选择 实验分别选用甲醇∶水；甲醇∶0.1%冰醋酸；甲醇∶0.4%冰醋酸；作为实验条件,结果发现在初始比例为甲醇∶0.4%冰醋酸(40∶60)时,进行梯度洗脱的时候,岀峰能够很好地分离,峰形很好,缩短分析时间。

［1］王潞,赵烽,刘珂.牛蒡子苷元诱导人白血病细胞凋亡的作用及机制[J].药学学报,2008,43(5):542-547.

［2］蒋淑敏.牛蒡化学成分和药理作用的研究现状[J].时珍国医国药,2001,12(10):941-942.

［3］刘世名,董国霞,陈靠山.牛蒡叶中绿原酸的提取工艺优化[J].中国药学杂志,2003,38(9):659-661.

［4］刘世名,陈靠山.牛蒡叶中微量木脂体牛蒡子苷和牛蒡子苷元的分离与鉴定[J].色谱,2003,21(1):52-55.

［5］郝林华,陈靠山,李光友.耐盐植物牛蒡的研究进展与应用[J].海洋科学,2004,28(5):69-72.

［6］米靖宇,汪志超,宋纯清.高效液相色谱法测定不同采购地牛蒡子中牛蒡子苷和苷元的含量[J].时珍国医国药, 2004,15(11):737-739.

［7］雷海民,毕葳,李强,等.不同产地牛蒡子药材RP-HPLC指纹图谱研究[J].中药材,2006,29(11):1166-1168.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.029

Determination of Effective Constituents in Fructus Arctii by Wavelength Switching Method of HPLC

SUN Yan-tao1,2,ZHAO Lan-ying1,LI Ting-ting1,ZHAO Lei3,JIANG Da-yu1,2
(1.College of Chemistry,Jilin Normal University,Siping 136000,China;2.Key Laboratory of Preparation and Applications of Environmmental Frendly Materials,Jilin Normal University,Ministry of Education China,Siping 136000,China;3.Siping Institute for Food and Drug Control,Siping 136000,Jilin,China)

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of three active components inFructus arctii.MethodsThe HPLC analysis was carried out on TC-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)column at the temperature of 25℃.The mobile phase composed of methanol and 0.4%glacial acetic acid with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL·m in-1.The detection wavelength was280 nm shifted to 326 nm.The sample loading volume was10μL.ResultsThe linear range for chlorogenic acid,arctiin,and arctigenin was 0.027 3-5.460 0,0.150 0-18.000 0,and 0.030 3-6.060 0μg,respectively.The linear equation was Y=1 106.476X-11.452,Y=1 026.014X+20.391,and Y=287.661X+ 4.045,respectively.The average recovery of chlorogenic acid,arctiin,and arctigenin was 99.55%,99.42%and 99.40%, respectively.ConclusionThemethod is quick,accurate,and reproducible.It can be used for content determination and quality control forFructus arctii.

Fructus arctii;Chlorogenic acid;Arctiin;Arctigenin

R282.71;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0100-03

2013-03-18

2013-04-18

*吉林省教育厅十二五基金项目(2012177)

孙艳涛(1979-),女,吉林辽源人,副教授,博士,主要从事色谱与光谱研究。电话：0434-3292154,E-mail：1979yanzi@163.com。

姜大雨(1972-),男,吉林延吉人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事色谱与光谱研究。电话：(0) 13224441430,E-mail：1979yanzi@163.com。