高效液相色谱法测定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量*

张丽珍,周之荣

(1.广东药学院附属门诊部,广州 510240;2.广东药学院公共卫生学院卫生检验与卫生化学系,广州 510310; 3.广东省分子流行病学重点实验室,广州 510310)

高效液相色谱法测定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量*

张丽珍1,周之荣2,3

(1.广东药学院附属门诊部,广州 510240;2.广东药学院公共卫生学院卫生检验与卫生化学系,广州 510310; 3.广东省分子流行病学重点实验室,广州 510310)

目的 建立同时测定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量的方法。方法采用高效液相色谱法(HPLC):色谱条件为Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱分离,检测波长为290 nm,流动相为乙腈-水进行梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,柱温为30℃,理论板数不低于3 000。结果桂皮醛进样量在0.025～0.500μg,橙皮苷进样量在0.10～2.00μg范围内与峰面积积分值线性关系均良好;在精密度实验、稳定性实验、重复性实验中,桂皮醛和橙皮苷峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.16%和1.03%,1.27%和1.08%,1.23%和1.28%;桂皮醛的平均加样回收率为99.24%,RSD为1.65%(n=9),橙皮苷的平均加样回收率为99.39%,RSD为1.85%(n=9)。结论该方法具有良好的专属性和重复性,加样回收率实验符合要求,能准确、稳定地对四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量进行定量测定,可作为该制剂的质量控制方法。

四味清口含片;桂皮醛;橙皮苷;色谱法,高效液相;含量测定

四味清口含片处方源于《华佗神方》,由桂心、甘草、细辛、广陈皮组成。该方理气和胃,阳通胃气和降,芳香化浊除臭,具有防治口臭等功效[1]。由于处方中有几味中药的口感不好,为方便患者服用,丰富临床用药剂型,本课题组研制了能在口腔内缓缓溶化而发挥对口臭治疗作用的口含片[2]。方中桂心为君药,桂心为肉桂加工过程中检下的边条除去栓皮者,主要含挥发油桂皮醛等成分。广陈皮主要成分为橙皮苷、新橙皮苷、对羟福林、黄酮化合物、挥发油等。桂心中的桂皮醛含量测定方法有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[3]、气相色谱(gas chromatography,GC)[4]、薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)[5];广陈皮中的橙皮苷含量测定方法有HPLC[6]、超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)[7]、TLC[8]。为有效控制四味清口含片产品质量,保证其用药安全有效,采用HPLC建立该制剂主药桂心所含主要有效成分桂皮醛和广陈皮中橙皮苷含量的同时测定方法,并对3批样品进行了含量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ultimate 3000高效液相自动进样色谱仪,紫外检测器(Dionex公司);CPA225D电子分析天平(Sartorius公司);KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);U-3010型紫外-可见分光光度计(日本日立公司)。

1.2 试药 四味清口含片(批号:20130501, 20130510,20130520)由本实验室自制;桂皮醛对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110710-201012,纯度:≥99.5%);橙皮苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110721-200613,纯度:≥98.5%);甲醇、乙腈为色谱醇。实验用水为双蒸水;所用其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定指标的确定 选择桂皮醛、橙皮苷作为四味清口含片质量控制的指标成分进行定量研究,建立HPLC同时测定四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷含量的方法。

2.2 色谱条件 色谱柱:Inertsil ODS-SP(4.6 mm× 150 mm,5μm);流动相:乙腈(A)和水(B),梯度洗脱(0～5 min:28%A;～10 min:28%A→35%A;～18 min:65%A;～20 min:35%A→28%A);检测波长290 nm;流速1.0 mL·min-1;柱温:30℃。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取置五氧化二磷(P2O5)干燥器中放置24 h的桂皮醛、橙皮苷对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇使完全溶解,制成含桂皮醛0.2 mg·mL-1和含橙皮苷0.8 mg·mL-1的混合储备液。精密量取储备液配成每毫升中含桂皮醛20μg和含橙皮苷80μg的溶液,作为混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取本品10片,研细,过4号筛,取约0.3 g,精密称定。置棕色瓶中,精密加入甲醇50 mL,称定质量,超声提取(功率250W,频率40 kHz) 20 min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液用孔径0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.5 阴性对照溶液的制备

2.5.1 缺桂心阴性对照溶液的制备 取处方中除桂心外的其他药材,按处方剂量及制法和工艺要求制备缺桂心阴性样品,称取0.3 g,按“2.4”项下方法制备,即得。

2.5.2 缺广陈皮阴性对照溶液的制备 取处方中除广陈皮外的其他药材,按处方剂量及制法和工艺要求制备缺广陈皮阴性样品,称取0.3 g,精密称定。按照“2.4”项下方法制备,即得。

2.5.3 缺桂心和广陈皮阴性对照溶液的制备 取处方中除桂心和广陈皮外的其他药材,按处方剂量及制法和工艺要求制备缺桂心和广陈皮阴性样品,称取0.3 g,精密称定。按“2.4”项下方法制备,即得。

2.6 系统适应性实验 分别精密吸取混合对照品、供试品、缺桂心阴性对照溶液、缺广陈皮阴性对照溶液、缺桂心和广陈皮阴性对照溶液各10μL,按“2.2”项条件进样。在该色谱条件下,桂皮醛与橙皮苷和其他成分可达基线分离,桂皮醛和橙皮苷保留时间分别为15.2和3.9 min,理论板数不低于3 000,各成分分离度均＞1.5;不含广陈皮阴性对照溶液在橙皮苷出峰区间未出现相应色谱峰,不含桂心阴性对照溶液在桂皮醛出峰区间未出现相应色谱峰,不含桂心和广陈皮阴性对照溶液在桂皮醛、橙皮苷出峰区间未出现相应色谱峰。表明该方法专属性较好,阴性对照无干扰。色谱图结果见图1。

2.7 方法学考察

2.7.1 线性范围的考察 精密量取混合对照品储备液适量,用甲醇稀释制成浓度为含桂皮醛分别为2.50, 5.00,10.00,20.00,30.00,40.00,50.00μg·mL-1的系列对照品溶液(橙皮苷含量分别为10.0,20.0, 40.0,80.0,120.0,160.0,200.0μg·mL-1),摇匀。在“2.2”项条件下进样10μL,记录各色谱峰峰面积;以峰面积均值为纵坐标(Y)、进样量(μg)为横坐标(X),绘制标准曲线,得桂皮醛回归方程Y=4 148.534X+ 40.763,r=0.999 7,橙皮苷回归方程Y=2 304.509X+ 126.348,r=0.999 9。结果显示,桂皮醛进样量在0.025～0.500μg、橙皮苷进样量在0.10～2.00μg范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.7.2 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液10μL,在“2.2”项条件下平行测定6次,记录桂皮醛和橙皮苷峰面积,平均峰面积分别为862.90, 1 980.82,其RSD分别为为1.16%,1.03%,表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性实验 精密吸取同一批(批号: 20130501)供试品溶液,按“2.2”项下色谱条件,分别于0,5,6.5,8,9,12 h进样10μL,测定记录峰面积,计算相对标准偏差。结果供试品溶液的桂皮醛平均质量分数为3.27 mg·g-1,RSD为1.27%;橙皮苷平均质量分数为13.01 mg·g-1,RSD为1.08%,表明供试品溶液中的桂皮醛和橙皮苷均能够在12 h内保持稳定。

2.7.4 重复性实验 取同一批样品(批号: 20130501),共取6份、各约0.3 g,精密称定。按“2.4”项下方法制备供试品溶液,平行操作6份,按“2.2”项下色谱条件,测定峰面积并计算含量。结果桂皮醛平均质量分数为3.27 mg·g-1,RSD为1.23%;橙皮苷平均质量分数为13.01 mg·g-1,RSD为1.28%,表明重复性良好。

A.缺广陈皮和桂心阴性对照品;B.缺桂心阴性对照品;C.缺广陈皮阴性对照品;D.桂皮醛和橙皮苷对照品;E.供试品;1.橙皮苷;2.桂皮醛图1 四味清口含片中桂皮醛的和橙皮苷的HPLC图A.negative reference substance without Citrus Chachiensis Hortorum and Cortex Cinnamomi;B.negative reference substance without Cortex Cinnamomi;C.negative reference substance without Citrus Chachiensis Hortorum;D.reference substance of Citrus Chachiensis Hortorum and Cortex Cinnamomi;E.sample;1. hesperidin;2.cinnamaldehydeFig.1 HPLC chromatograms of cinnamaldehyde and hesperidin in siweiqing buccal tablets

2.7.5 加样回收率实验 取已知含量的同一批号(20130501)四味清口含片(约相当于桂皮醛3.27 mg·g-1、橙皮苷13.01 mg·g-1)适量,研细,混匀,取约0.25 g,精密称定,平行取9份,分别置于50 mL棕色量瓶中,再分别精密加入桂皮醛0.2 mg·mL-1和含橙皮苷0.8 mg·mL-1的混合储备液2.0,2.0,2.0,4.0,4.0,4.0,6.0,6.0,6.0 mL,续加甲醇适量,超声处理20 min,取出,放置至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用孔径0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得加样回收供试品溶液;分别精密吸取10μL,按“2.2”项下色谱条件测定,计算桂皮醛和橙皮苷回收率。桂皮醛的加样回收率为97.75%～102.02%,平均值为99.24%,RSD为1.65%(n=9),橙皮苷的加样回收率97.36%～102.42%,平均值为99.39%,RSD为1.85%(n=9)。

2.8 样品含量测定 取3批四味清口含片样品(批号:20130501,20130510,20130520),分别按照“2.4”项下方法制备供试品溶液,每批平行操作3份。分别精密吸取各供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,按“2.2”项下条件测定,计算桂皮醛和橙皮苷含量。结果3批四味清口含片样品中桂皮醛含量分别为每片1.63,1.64,1.64 mg,橙皮苷含量分别为每片6.50, 6.51,6.51 mg。

3 讨论

3.1 测定波长的选择 桂皮醛在290 nm波长处有最大吸收,在220～320 nm波长之间均有吸收,在波长250 nm处吸收比较平滑;橙皮苷在283 nm波长处有最大吸收,为了兼顾桂皮醛和橙皮苷的同时测定,本方法在290 nm波长下测定,橙皮苷的灵敏度也可以满足准确测定的要求。故选择290 nm为检测波长。

3.2 提取方式的选择 待测成分桂皮醛属于易挥发性物质,所以提取方式未考虑热提取法(如回流提取、索氏提取等),文献[3,9]报道的提取方式也以超声提取为主。实验中对提取时间(20,30,40 min)、超声波仪器的功率和频率、是否过夜等不同影响因素进行逐一考察,结果显示:若超声处理1次,则以20 min为佳,原因是随着超声处理时间的延长,提取液温度会有一定程度地升高,已提取出的桂皮醛会部分挥发逸失。超声波仪器的功率对提取效率影响不大,功率高则提取效率稍高(约3.5%)。《中华人民共和国药典》2010年版肉桂项下供试品溶液的制备采用“超声-放置过夜-超声”的处理方式。本次实验也将该方法的提取效果与直接超声提取一次进行比较,结果“超声-放置过夜-超声”方式的提取效率只相当于直接超声提取一次的89%。《中华人民共和国药典》2010年版方法测定肉桂中的桂皮醛,放置过夜的目的是为了使溶剂充分渗入药材的组织细胞内部而使桂皮醛充分溶出;而四味清口含片中的桂皮醛则存在于挥发油的β-环糊精包合物中,超声(功率250 W,频率40 kHz) 20 min足以使其完全溶出,放置过夜反而会导致桂皮醛逸失而使测定结果偏低。综合上述因素,选择超声处理20 min提取桂皮醛,橙皮苷的回收率也能达到要求。

3.3 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-醋酸-水系统,结果表明以乙腈-水为流动相梯度洗脱,可以使桂皮醛和橙皮苷的分离良好,峰形也较理想。

3.4 桂皮醛的使用操作 桂皮醛对光线敏感[10],在实验过程中采用棕色量瓶配制溶液并存放在阴凉处避光,快速操作。

笔者所建立的含量测定方法具有良好的精密度、准确性和重复性,专属性好,可用于四味清口含片中桂皮醛和橙皮苷的含量测定,可作为该制剂的质量控制方法。

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[2] 张丽珍,詹晓如,胡奕勤,等.四味清口含片处方的优化及制备工艺研究[J].中国医药科学,2013,3(21):51-56.

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[4] 李启艳,朱日然.GC测定阳和胶囊中桂皮醛的含量[J].中成药,2006,28(1):150-151.

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.023

Determ ination of Cinnamaldehyde and Hesperidin in Siweiqing Buccal Tablets by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Li-zhen1,ZHOU Zhi-rong2,3
(1.The Clinic Attached to Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510240,China;2.Department ofSanitary Analysisand Sanitary Chemistry,School ofPublic Health, Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510310,China;3.Guangdong Key Laboratory of Molecular Epidemiology,Guangzhou 510310,China)

Objective To establish a method for the determination of hesperidin and cinnamaldehyde insiweiqingbuccal tablets.MethodsA high performance liquid chromatography(HPLC)method was established.The chromatographic conditions were as follows:the chromatographic column Inertsil ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)with the mixture of acetonitrile and water asmobile phase in gradientmode,the detection wavelength of290 nm,the flow rate of1.0 mL·min-1,the column temperature of30℃,the theoretical plate number no less than 3 000.ResultsThe linear relationship between content and peak area was obtained in the range of 0.025-0.500μg for cinnamaldehyde and 0.10-2.00μg for hesperidin.RSD of the peak area of cinnamaldehyde and hesperidin for the precision test,the stability test and the repeatability test were 1.16%and 1.03%,1.27%and 1.08%,1.23%and 1.28%,respectively.The average recovery of cinnamaldehyde was 99.24%with RSD of 1.65%(n=9).The average recovery of hesperidin was99.39%with RSD of1.85%(n=9).ConclusionThemethod can be applied to quantitative assay of cinnamaldehyde and hesperidin insiweiqingbuccal tablets with good reproducibility and specificity.The recovery resultmet the acceptance criteria.The method can effectively control the quality ofsiweiqingbuccal tablets with good specificity,reproducibility and stability,and can be applied to the quality control ofsiweiqingbuccal tablets.

Siweiqingbuccal tablets;Hesperidin;Cinnamaldehyde;Chromatography,high performance liquid;Content determination

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)12-1627-04

2014-01-02

2014-02-01

*广东省中医药局项目(20122109)

张丽珍(1963-),女,江西东乡人,副主任中药师,主要从事中草药提取、分析测定研究工作。电话:020-34074636,E-mail:gzzlzhang@163.com。

周之荣(1965-),男,四川南充人,教授,硕士,研究方向:环境分析化学。电话:020-34055201,E-mail: zhouzhirong1965@sina.com。