依维莫司对人非小细胞肺癌细胞系A549放射增敏作用*

陈豫,褚倩,郭娟,黄玉,李文雯,田逸俊,夏曙,于世英

(华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科,武汉 430030)

·药物研究·

依维莫司对人非小细胞肺癌细胞系A549放射增敏作用*

陈豫,褚倩,郭娟,黄玉,李文雯,田逸俊,夏曙,于世英

(华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科,武汉 430030)

目的 通过使用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR抑制药依维莫司抑制A549细胞mTOR信号通路,研究依维莫司是否具有放射增敏作用。方法单纯放射治疗(放疗)或联合依维莫司作用于人非小细胞肺癌细胞系A549,采用噻唑蓝(MTT)法测定依维莫司对A549细胞抑制率并计算半数抑制浓度(IC50)。应用药物20%抑制浓度(IC20)作用24 h后X线2,4,6,8 Gy照射。计算细胞克隆存活分数及多靶单击模型拟合生存曲线,并计算平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)、照射剂量2 Gy下细胞存活分数(SF2)和放射增敏比(SER)。采用Western blot方法检测γ-H2AX蛋白的表达,并分析相对灰度值。结果依维莫司联合放疗可明显提高A549细胞对射线的敏感性,依维莫司+照射组D0、Dq及SF2均明显低于单纯照射组,SER为1.36。依维莫司+照射组X线照射后24 h点γ-H2AX蛋白残余量明显高于单纯照射组。结论依维莫司抑制mTOR信号通路能够提高A549细胞的放射敏感性。

依维莫司;癌,非小细胞肺;放射增敏;信号转导通路

放射治疗(radiotherapy,放疗)是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗的重要手段。近年来,各种分子靶向药物运用于放射增敏的基础研究,以期提高放疗效果,但目前临床上尚无一种小分子抑制剂类药物运用于肺癌放射增敏治疗[1]。依维莫司(everolimus,RAD001)作为口服的小分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制药,已获得美国食品药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于转移性肾癌的治疗。在NSCLC中,也已开展依维莫司单药治疗ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者的Ⅱ期临床实验[2]。因此,笔者以人非小细胞肺癌A549细胞系为研究对象,使用依维莫司抑制mTOR通路,以期提高A549细胞放射敏感性,并探讨mTOR信号转导通路在放射增敏中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 依维莫司由诺华公司提供;H2AX抗体购自Cell Signaling Technology;γ-H2AX抗体(pS139)购自EPITOMICS;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司;噻唑蓝(thiazolyl blue, MTT)试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司; RS2000型实验用生物学X线辐照仪(美国RAD SOURCE公司)。

1.2 细胞培养 A549为人肺腺癌细胞株,为本实验室保存的单层贴壁生长细胞,使用含10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培养液,于37℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中培养。

1.3 依维莫司对A549细胞的增殖抑制作用 采用MTT法测定依维莫司对A549细胞抑制率。确定放射增敏浓度。将对数生长期的A549细胞以适当浓度接种于96孔板,培养过夜贴壁后,加入依维莫司浓度分别为0.1,1,10,100,1 000 nmol·L-1的培养液。药物作用72 h后,吸去含药物的培养液,每孔更换新鲜无血清培养液100μL并加入MTT 10μL,37℃避光培养4 h,去掉MTT加入二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)每孔100μL,水平摇床上摇动15 min,酶标仪波长492 nm测定吸光度(A)值,计算细胞存活率。细胞存活率=(加药组A值-空白组A值)/(未加药组A值-空白组A值)。按药物效应中效方程式法计算药物半数抑制浓度(50%inhibition concentration,IC50)。

1.4 细胞照射 对数生长期细胞置于生物学X线辐照仪样品箱中,设备常用输出剂量为1 Gy·min-1,根据所需剂量设置照射时间。

1.5 克隆形成法测定依维莫司对A549细胞的放射增敏作用 取依维莫司的20%细胞抑制浓度(20% inhibition concentration,IC20)为药物增敏浓度[3]。实验分组为:单纯照射组、依维莫司+照射组,每组设置复皿3个。取对数生长期细胞接种于60 mm细胞培养皿,加入含有药物的培养液作用24 h,0,2,4,6,8 Gy X线照射细胞后更换不含药物培养液继续培养14 d。每皿加入甲醇溶液1 mL固定细胞20 min,结晶紫染色15 min。自然干燥后计数细胞克隆(50个/克隆),计算集落形成率(plating efficiency,PE)及细胞存活分数(surviving fraction,SF)。PE(%)=空白对照组集落数/空白对照组接种细胞数×100%;SF=某一剂量照射实验组的集落数/该组细胞接种数×PE。加药照射组细胞存活分数均用单纯给药组细胞存活分数校正,以消除药物作用对SF的影响。

1.6 细胞蛋白表达检测 取对数生长期细胞按上述分组给药作用24 h,X线4 Gy照射细胞后,于0,30, 60 min和4,12,24 h时间点进行处理。细胞裂解液(50 mmol·L-1Tris-盐酸,150 mmol·L-1氯化钠,1% NP-40,0.5%去氧胆酸钠,0.02%叠氮钠,0.1%十二烷基硫酸钠,100μg·mL-1苯甲基磺酰氟,1μg·mL-1抑肽酶,1%磷酸化酶抑制剂)提取细胞总蛋白,聚氰基丙烯酸正丁酯法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液,加热变性后分装保存于-80℃冰箱。取60μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳,将凝胶中的蛋白电转移到硝酸纤维素膜上,室温封闭液(TBS+5%脱脂奶粉+0.5%聚山梨酯-20)封闭1 h,加入相应浓度一抗(H2AX 1∶1 000,γ-H2AX 1∶5 000)4℃孵育过夜, TBS-T洗膜后加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育1 h,采用增强化学发光法(enhanced chemiluminescene,ECL)曝光胶片,显像。使用AlphaEaseFC系统对结果进行灰度值分析。

1.7 统计学方法 由SPSS18.0版统计软件完成数据分析,结果以均数±标准差(±s)表示,t检验比较两组差异。以P＜0.05表示有差异有统计学意义。GraphPad Prism 5进行克隆形成实验数据分析及多靶单击模型曲线拟合,计算平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)、照射剂量2 Gy下细胞存活分数(survival fraction at 2 Gy, SF2)和放射增敏比(sensitivity enhancement ratio,SER)。

2 结果

2.1 依维莫司对A549细胞抑制作用 依维莫司对A549细胞有明显地抑制作用,且该作用存在剂量依赖性。根据药物效应中效方程式法计算药物IC50,依维莫司的IC50为(74.6±1.1)nmol·L-1。通过中效作图法,依维莫司的IC20约为0.8 nmol·L-1,取IC20为放射增敏浓度。

2.2 抑制mTOR提高A549细胞对射线的敏感性通过多靶单击模型拟合细胞生存曲线发现,依维莫司+照射组的D0、Dq及SF2均明显低于单纯照射组,且SER值为1.36。抑制mTOR后可明显地提高A549细胞对射线的敏感性。结果见表1,图1。

2.3 DNA双链断裂标志γ-H2AX及H2AX蛋白表达变化 Western blot检测两组0,0.5,1,4,12及24 h点γ-H2AX蛋白表达。与单纯照射组比较,依维莫司+照射组γ-H2AX蛋白表达持续时间延长,在24 h点残余量增高。结果见图2,3。

表1 两组多靶单击模型拟合实验参数Tab.1 Fitted parameters ofmultitarget one-hitmodel in two groups

图1 两组A549细胞生存曲线图Fig.1 Survival curves of A549 cells in two groups

图2 两组γ-H2AX蛋白表达变化电泳图Fig.2 Electrophotogram ofγ-H2AX protein expression in two groups

图3 两组A549细胞γ-H2AX蛋白灰度值变化柱状图Fig.3 Histograms of the gray values ofγ-H2AX protein in A549 cells in two groups

3 讨论

PI3K/Akt/mTOR信号通路调节细胞一系列重要的生理活动,包括细胞生长、增殖及生存[4],抑制这条通路治疗肿瘤成为研究热点之一[5]。丝氨酸-苏氨酸激酶mTOR是蛋白质合成的主要调节因子,在与细胞生长及生存相关的其他重要进程如血管发生及自噬中也起到关键作用[6]。mTOR在细胞中存在两种不同功能的复合体,分别是mTORC1和mTORC2。mTORC1复合体由mTOR、Raptor、mLST8和PRAS40蛋白组成,对大环内酯类抗生素雷帕霉素及其类似物敏感[7]。作为雷帕霉素类似物,与前者相比,依维莫司在分子结构上增加了羟乙基,使其水溶性更好,提高了口服吸收效率,因此具有更好的药动学效应[8]。与雷帕霉素一样,依维莫司在细胞内与FK506结合蛋白-12(FKBP-12)形成复合体后被mTOR识别并抑制其活性[9]。其抑制作用也主要针对mTORC1,通过抑制mTOR的非正常激活可抑制肿瘤细胞的生长、代谢、生存及血管生成等[10]。

放射线可直接或间接作用于DNA,导致DNA损伤,其中DNA双链断裂(DNA double strand break, DSBs)是最致命的。研究显示当DSBs产生后,人组蛋白H2A家族成员H2AX蛋白C端Ser残基可被DNAPK及ATM等PI3K家族成员磷酸化。ROGAKOU等[11]通过研究首次发现这一现象并将磷酸化的H2AX定名为γ-H2AX。随后的研究发现,电离辐射后细胞中残存的γ-H2AX的数量可代表未被修复的DNA双链断裂损伤的数量。如果损伤不能被及时正确地修复便可导致细胞凋亡,暴露后24 h残存的γ-H2AX的数量越多则表示此肿瘤细胞对放疗越敏感[12]。因此,笔者在本实验中选择γ-H2AX作为检测DSBs的指标,测定放疗后肿瘤细胞损伤程度,评估依维莫司对人肺非小细胞肺癌细胞系A549放射增敏作用。

本研究结果显示,依维莫司对A549细胞的IC50为(74.6±1.1)nmol·L-1,提示单用依维莫司具有药物浓度依赖的抗肿瘤作用,相关机制可能是由于细胞周期蛋白(cyclins)尤其是cyclin D的减少抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent protein kinases, CDKs)的活化相关[13]。取IC20作为增敏浓度,研究结果显示,在mTOR上游调控基因PIK3CA野生型的人肺非小细胞肺癌细胞系A549中,依维莫司具有明显的增敏效果(SER=1.36)。相关机制可能是抑制mTOR后进行照射,阻断了mTOR依赖途径的激活,抑制下游细胞修复相关基因的启动,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖,增大了放射线引起的损伤效应[14]。这一结果与KIM等[6]在张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)缺失的非小细胞肺癌中的研究结论一致,mTOR抑制剂可抑制同源重组及非同源断端链接两种DNA损伤主要的修复方式,从而起到放射增敏作用。进一步的蛋白研究显示,依维莫司+照射组放疗后24 h点,γ-H2AX残留量较单纯照射组明显增加,证实了前面克隆形成的结果。CHEN等[15]在使用雷帕霉素抑制乳腺癌细胞系MCF7 mTOR通路的研究中,也观察到了类似现象。推测与抑制mTOR通路后,下调了染色体完整性相关的蛋白表达,阻止DNA损伤修复等机制相关[16]。

综上所述,依维莫司抑制mTOR通路联合放疗可增强非小细胞肺癌细胞系A549对射线的敏感性,说明mTOR通路在肺癌细胞损伤修复中具有一定作用。但本研究目前仅限于mTOR上游调控基因PIK3CA基因野生型的细胞系中,若PIK3CA基因存在突变, mTOR处于持续激活状态,依维莫司是否具有放射增敏作用,仍有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.001

Effect of Everolimus on Radiosensitivity of Human Non-small Cell Lung Cancer Cell Line A549

CHEN Yu,CHU Qian,GUO Juan,HUANG Yu,LIWen-wen,TIAN Yi-jun,XIA Shu,YU Shi-ying
(Department ofOncology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To explore the effect of mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibitor everolimus on radiosensitivity of human non-small cell lung cancer cell line in vitro by using everolimus to inhibit mTOR signaling pathway of A549.MethodsHuman non-small cell lung cancer cell line A549 was subjected to radiation alone or in combination with everolimus treatment.The50%inhibition concentration(IC50)of everolimus in A549 cellswas detected bymethylthiazol tetrazolium (MTT)assay in vitro.Everolimus at the 20%inhibition concentration(IC20)was used to pretreat A549 cells for 24 h.Cells were then irradiated by X-ray with 2,4,6,8 Gy.The cell survival fraction was computed by clone formation.Cell survival curvewas fitted bymultitarget one-hit model,and mean lethal dose(D0),dose quasithreshold(Dq),survival fraction at 2 Gy(SF2),and sensitization enhancement ratio(SER)were calculated.The expression ofγ-H2AX was determined byWestern blotting and then the relative gray values were analyzed.ResultsEverolimus significantly improved the sensitivity of A549 cells to radiation.The D0, Dqand SF2of everolimus+irradiation group were significantly lower than those of irradiation group.The SER was1.36.The residual amount ofγ-H2AX protein in the everolimus+irradiation group was significantly higher than that of the irradiation group.ConclusionEverolimus inhibitingmTOR signaling pathway can increase the radiosensitivity of A549 cells.

Everolimus;Cancer,non-small cell lung;Radiosensitization;Signal transduction pathway

R979.1;R734.2

A

1004-0781(2014)12-1541-04

2014-04-15

2014-07-08

*吴阶平医学基金资助项目(320.6720. 10010);国家自然科学基金资助项目(81301929,81372664)

陈豫(1984-),女,湖北武汉人,实习研究员,硕士,研究方向:肿瘤信号转导通路及肿瘤放射生物学。电话: 027-83663476,E-mail:veta.chen@163.com。

于世英(1955-),女,四川绵阳人,教授,主任医师,博士生导师,研究方向:肿瘤诊断与综合治疗。电话:027-83663676,E-mail:syyu@tjh.tjmu.edu.cn。