PM 10暴露诱导大鼠心肌损伤效应研究

苗娟娟，桑楠

（山西大学 环境与资源学院，山西 太原 030006）

0 引言

近年来，随着工业化的快速推进，燃料燃烧、交通运输、房屋建设和冶金炼钢等带来了严重的大气颗粒物污染。而大气可吸入颗粒物（PM10）是空气动力学直径≤10μm的颗粒物，也是悬浮颗粒物中对环境和人类健康危害最大的一类。2010年中国环境公报显示［1］，环境保护重点城市总体平均的可吸入颗粒物浓度与上年相比仍有上升。2012年联合国环境规划署发布的《全球环境展望5》［2］中显示每年室外空气颗粒物污染可导致大约370万人死亡。因此，大气可吸入颗粒物污染所引发的健康问题不容忽视。

流行病学研究表明，大气颗粒物污染不仅会使居民呼吸系统疾病发生率增高，而且对心血管系统也将产生不良影响。Chang［3］和yang［4］等人的研究表明，大气污染，尤其是PM10、NO2、CO可以提高心血管疾病的住院率和死亡率。Puett［5］研究证实慢性颗粒物暴露会增加冠心病的发病率，而且在中老年以上和已患相关疾病的人群中表现明显［6］。

到目前为止，PM10与心血管疾病发病率增加的相关性研究主要集中在流行病学领域，利用实验动物模型确定效应发生的研究还鲜见报道。为此本文提出研究不同浓度和不同季节的PM10染毒对大鼠心脏组织的影响，检测心脏组织中炎症相关因子IL-1β、ICAM -1、COX-2和iNOS以及凋亡相关因子p53 m RNA水平的表达变化，旨在探讨PM10污染与心肌损伤效应之间的相关性，并为揭示颗粒物季节的差异可能会诱导机体不同程度的损伤效应提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 PM10采集及其悬浊液的制备

1.1.1 PM10的采集

用TH-150C型智能中流量采样器（武汉天虹）采集山西大学生活区的PM10，流量为100 L／min，每天采样24 h，采样时间为2010-03-15－2011-02-20，同时记录采样前后玻璃纤维滤膜的重量。采集完后，将滤膜密封在铝箔中，4℃储藏备用。

1.1.2 PM10悬浊液的制备

将载有颗粒物的滤膜剪成1 cm2的小块于烧杯中，加入适量的超纯水于超声振荡器上反复震荡30 min，同时加冰以保证水温在20℃以下，振荡结束后用六层纱布过滤，收集滤液真空冷冻干燥并称重，在4℃储存。在实验前，用生理盐水将颗粒物配制成浓度分别为0.3、1、3、10 mg／kg bw（body weight）的悬浊液，并超声振荡混匀。

1.2 实验动物和处理方法

1.2.1 采暖期不同浓度PM10染毒处理

实验用Wistar成年雄性大鼠30只，体重为180～200 g，由山西医科大学实验动物中心提供。将实验用大鼠按体重均分为5组（n＝6），即对照组和不同浓度（0.3、1、3、10 mg／kg bw）PM10处理组，对照组注入生理盐水，每3天染毒1次，共5次。在最后一次染毒48h后断头处死，取大鼠心脏组织，在液氮中快速冰冻，随后在－80℃储存备用。

1.2.2 不同季节PM10染毒处理

实验用Wistar成年雄性大鼠30只，体重为180～200 g，由山西医科大学实验动物中心提供。将实验用大鼠按体重均分为5组（n＝6），即对照组和不同季节（春、夏、秋和冬）PM10处理组（10 mg／kg bw），对照组注入生理盐水，每3天染毒1次，共5次。在最后一次染毒48 h后断头处死，取大鼠心脏组织，在液氮中快速冰冻，随后在－80℃储存备用。

1.3 检测方法

1.3.1 苏木素-伊红染色（H＆E）

对不同浓度PM10染毒处理后的大鼠心脏组织做苏木素－伊红染色（H＆E）观察。将大鼠断头处死后，立即取出心脏组织，在PBS溶解的质量分数4%多聚甲醛中固定组织，常规梯度酒精和二甲苯脱水，用石蜡包埋。组织切成5μm厚的切片常规脱蜡烘干后，苏木素染色，蒸馏水洗涤，氨水反蓝30 s，蒸馏水洗涤。伊红染色3 min，蒸馏水洗涤。脱水，晾干，封片，显微镜下观察。

1.3.2 荧光实时定量RT-PCR法

称取0.1g心脏组织，用TRIzol匀浆提取总RNA，通过测定RNA在260 nm处的吸光度来定量。使用反转录试剂盒（Ta KaRa Biotechnology Co.Ltd，Dalian）的操作说明将提取的RNA反转录成cDNA，于－20℃保存待用。将反转录后的cDNA稀释5倍待用。分别取稀释5倍后的cDNA样1μL，再分别加入等量的混合液（2μL PCR Buffer，3.5 mmol／L MgCl2，0.2 mmol／L d NTP），每个引物500 nmol／L，200 nmol／L Taq Man探针和1 U Taq DNA聚合酶）。引物和探针序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 数据分析方法

用Origin 7.0统计软件的One-way ANOVA检验染毒组与对照组的差异显著性（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 采暖期不同浓度PM 10暴露诱导大鼠心脏组织病理损伤检测结果

如图1所示，对照组心肌细胞横纹清楚，结构完整，细胞质分布均匀；随着PM10暴露浓度的增加，心肌纤维排列紊乱，心肌间质肿胀，间隙变宽，心肌细胞细胞核染色质边集，心肌细胞肌浆溶解出现空泡，局部有炎性细胞浸润，部分心肌细胞凋亡。

2.2 采暖期不同浓度PM10暴露对大鼠心脏组织炎症和凋亡相关因子表达的影响

如图2A所示，较高浓度（3、10 mg／kg）的PM10暴露可增加iNOS的mRNA表达水平，在10 mg／kg暴露浓度下达到对照组的1.66倍（P＜0.01）。如图2B所示，与对照组相比，大鼠心脏组织中p53 mRNA表达水平在低浓度PM10暴露时下降，在高浓度暴露时上升，而且均有统计学差异。

2.3 不同季节PM10暴露对大鼠心脏组织炎症相关因子表达的影响

由图3可知，春季PM10暴露下均可上调炎性相关因子IL-1β、ICAM-1、COX-2和iNOS的mRNA水平，且IL-1β与对照组相比表现有显著性差异（P＜0.01）。其余季节PM10暴露下对各炎性相关因子的mRNA水平影响不大，COX-2 m RNA水平在冬季PM10暴露下出现显著上调（P＜0.01）。

3 讨论

大气颗粒物作为一种复合污染物，对心脏组织的损伤毒性作用是多途径、多机制共同作用的结果。进入呼吸系统的颗粒物可引起肺部和全身的氧化应激或炎症反应，激活凝血机制，削弱血管功能和增加动脉硬化。颗粒物还可刺激肺部交感神经产生次级神经反射，改变自主神经反射等机制引发心律不齐等［7－8］。颗粒物致毒过程的关键阶段均是颗粒物进入呼吸道后引发的机体氧化应激和炎症［9］。研究表明颗粒物进入肺部，可以引起局部氧化应激，从而激活核转录因子（NF-κB）、细胞因子（IL-6、IL-8）的表达，引发全身炎症反应［10－11］。

Fig.1 HE staining of morphological characteristics of sections in rat heart after exposure to different concentrations of PM10（注：400×放大）图1 不同浓度PM 10暴露诱导大鼠心脏组织病理学变化

Fig.2 mRNA expression of inflammation and apoptosis related factors in rat heart after exposure to different concentrations of PM10（注：与对照组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）图2 不同浓度PM10暴露下大鼠心脏组织炎症和凋亡相关因子mRNA表达结果

NO是一种新型的信号分子，又是细胞毒性分子，可作为自由基同氧自由基相互作用，而导致细胞的损害，而NOS是NO合成的最主要的限速酶。诱导型一氧化氮合酶（iNOS）主要分布于星形胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞中，在正常状态下不起作用，当受到多种细胞因子刺激下，其编码基因被激活导致其爆发式催化合成，直至细胞死亡或者底物耗竭［12－13］。本实验结果表明，在冬季高浓度PM10暴露条件下，iNOS的表达明显增高，由此提示，PM10暴露可能通过刺激呼吸系统产生炎性介质和细胞因子，提高诱导型iNOS的活性，导致NO的产生，引发氧化应激反应，造成心脏组织的氧化损伤。

本实验以采暖期不同浓度PM10暴露染毒处理后，高浓度PM10暴露下iNOS mRNA水平显著增加，表明高浓度PM10暴露显著诱导大鼠心脏组织炎症反应的发生，而对应的HE染色观察结果与此结果一致。凋亡相关因子p53的表达随PM10暴露浓度的增加呈现先降低后增高的趋势，提示高浓度PM10暴露也可能会伴随有凋亡反应的发生，但还有待进一步实验证明。

Fig.3 mRNA expression of inflammation related factors in rat heart after exposure to different seasons of PM10（注：与对照组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）图3 不同季节PM10暴露下大鼠心脏组织炎症相关因子mRNA表达结果

有文献指出，颗粒物的生物效应与其自身的粒径大小、化学组成、比表面积、来源和浓度等有关［14］，而进一步研究发现不同季节产生的颗粒物引起的生物效应也有差异。在颗粒物诱导的炎症反应的发生中，主要参与的炎症相关因子有IL-1β、ICAM-1、COX-2和iNOS。IL-1β作为体内炎性因子级联反应的始动因子，在维持正常机体内环境稳态和致心血管及其他疾病方面发挥着重要调节作用［15－16］，是一种敏感和特异的急性期炎性指标，主要由活化的巨噬细胞产生。ICAM-1属于黏附分子中免疫球蛋白超家族成员，是炎症介导物质，通过介导细胞与细胞间，细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互粘连，促使白细胞贴壁、外渗、聚集，并增强抗原表达和淋巴细胞活化，促进炎症的发生和发展。正常情况下，ICAM-1呈低水平表达，当发生免疫反应时受各种刺激因素影响后表达上调，参与各种免疫炎性反应。ICAM-1表达增强对于免疫炎症反应的发生是必需的［17］。COX-2是炎症过程中一个重要的诱导酶，诱导产生前列腺素类和自由基等［18］，静息状态下在正常组织中无表达或者弱表达，当受到细胞内外各种因素的刺激时，其合成与表达就会增强。iNOS作为炎性反应中的关键酶，在生理状态下不表达，在病理状态下（如缺氧缺血和神经损伤后）表达明显增加。

由采暖期不同浓度PM10对大鼠染毒处理的实验结果得出，颗粒物的最大效应浓度为10 mg／kg。为了进一步探讨颗粒物毒性的季节差异，我们使大鼠暴露于春夏秋冬不同季节（浓度均为10 mg／kg）PM10下，并检测了心脏中各炎症因子的表达。结果显示，春季和冬季PM10可以上调COX-2和iNOS的mRNA表达，表明春季和冬季PM10诱导了大鼠心脏组织中炎症反应发生。而其他季节PM10暴露下，各炎症因子表达变化不明显。上述结果提示，春季和冬季PM10可能通过诱导炎症反应发生进而导致心肌损伤，这种效应与颗粒物的季节有关。春季位于采暖后期，大气中颗粒物污染依然十分严重，这可能是造成春季颗粒物产生明显生物损伤效应的重要原因。

4 结论

本研究结果表明，高浓度PM10暴露可显著诱导大鼠心脏组织炎症反应发生进而造成心肌损伤，而不同季节PM10暴露造成的损伤效应也不同，以春季和冬季的效应最明显，这提示人们采暖期间和采暖后期颗粒物污染严重，应注意适当防护。

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