三种来源的石榴多酚抗氧化活性比较

李国秀，李建科，马文哲

（1. 杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西杨凌 712100；2. 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062）

石榴（Punica grantum L.）为石榴科石榴属植物，别名安石榴、若榴、丹若、金罂、金庞、涂林、天浆等，在我国栽培广泛，主要分布于陕西、山东、安徽、四川和云南五省。石榴自古以来就是一种药食两用植物，其果实不仅营养丰富，而且富含多种生理活性物质。近代科学研究证实，石榴果实具有预防和治疗心脑血管疾病、肝病、癌症以及延缓衰老、增强机体免疫力等功效，而这些功效很可能来自于果实中的多酚类物质[1-6]。本研究以石榴果实为研究对象，以石榴汁以及石榴加工副产物果皮、籽粒废渣为原料，在前期对其各部位（皮、汁、渣）多酚进行提取和纯化工艺研究的基础上，进一步考察和比较了不同来源的石榴多酚抗氧化活性，以进一步揭示石榴的功能价值，也可为石榴多酚的合理开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

净皮甜石榴（Punica granatum‘jingpitian’） 为收获季节采收陕西临潼的成熟石榴；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·，C18H12N5O6)美国Sigma公司生产；茶多酚（纯度99%） 上海哈灵生物科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

JFSD-70实验室粉碎磨 上海市嘉定粮油检测仪器厂；HHW-21CU-600电热恒温水浴锅 上海福玛实验设备有限公司；KQ3200B 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TDL-4型离心机 上海安亭科学仪器厂；WFJ 2000型可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；ALPHA1-4型真空冷冻干燥机 德国 CHRTST公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；精密微量移液器 德国 Eppendorf；H-1微型混和器 上海康禾光电仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 三种来源的石榴多酚提取物的制备 石榴的预处理：新鲜石榴，手工去皮剥籽。石榴皮经自然风干后粉碎备用，其水分含量为7.78%；石榴籽粒（即可食部分）用组织捣碎机破碎后，用200目纱布四层过滤，分别收集石榴渣和石榴汁。石榴汁迅速采用4000r/min离心10min，取上清液于-18℃条件下贮存；石榴渣置于干燥箱中50℃条件下鼓风干燥36h后粉碎备用，其水分含量为5.27%。

石榴皮、石榴渣多酚的制备：石榴皮/渣→干燥→粉碎→过筛（40目）→超声辅助溶剂浸提（60%乙醇、温度60℃、料液比1∶20、时间30min、超声功率120W）→过滤→离心→上清液为多酚粗提液→减压蒸馏回收溶剂→有机溶剂萃取法纯化富集（石油醚、氯仿萃取除杂，乙酸乙酯萃取富集）→减压蒸馏回收溶剂→真空冷冻干燥→石榴皮/渣多酚提取物。

石榴汁多酚的制备：取石榴原汁采用有机溶剂萃取法（石油醚、氯仿萃取除杂，乙酸乙酯萃取富集）进行多酚的纯化富集，减压蒸馏除去溶剂后真空冷冻干燥，得到石榴汁多酚提取物。

提取物中总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu比色法（FC法）[7]，以没食子酸为标样。

多酚得率（%）= 提取物中多酚质量/原料质量×100

多酚纯度（%）= 提取物中多酚质量/提取物质量×100

1.2.2 体外抗氧化活性测定 将三种来源的石榴多酚提取物以总酚质量浓度为标准，分别配制成不同总酚浓度的溶液作为样品溶液，避光、低温保存备用。每个测定项目均以茶多酚、BHT（二丁基羟基甲苯）作为阳性对照。

总还原能力的测定：采用普鲁士兰法，参照Kaur等[8]的方法测定。清除超氧阴离子自由基（O2·-）能力测定：采用核黄素-光-氮蓝四唑体系测定[9]。清除羟自由基（·OH）能力测定：采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定[10]。清除DPPH·活性测定：参考Negi等[11]和 Kaur等[8]的方法测定。抗脂质过氧化能力的测定：采用张尔贤等[12]确定的方法测定。

1.3 统计分析

数据采用DPS Ver.3.01数据处理软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 三种来源的石榴多酚提取物的制备结果

采用超声波辅助提取法优化工艺对石榴皮、石榴渣中多酚类物质进行提取，粗提液总酚得率分别为石榴皮23.68%、石榴渣0.69%。经有机溶剂萃取法纯化富集后，石榴皮提取物总酚得率为5.88%，总酚含量为79.83%；石榴渣提取物总酚得率为0.13%，总酚含量为23.76%。经测定，石榴原汁中总酚含量为0.75%，经有机溶剂萃取法纯化富集后，石榴汁提取物总酚含量为10.56%。

2.2 石榴多酚的还原能力

图1 石榴多酚的总还原能力Fig.1 Deoxidization capability of pomegranate polyphenols

采用普鲁士兰法测定多酚的总还原能力，吸光度越大，表示其还原能力越强，抗氧化活性越高。从图1中看出，随着总酚质量浓度的增加，吸光度增大，并且在测定的浓度范围（5～100mg/L）内，其剂量效应关系表现为良好的直线相关性。当浓度均为60mg/L时，三种石榴多酚的还原能力略低于茶多酚，但明显高于BHT，表明三种石榴多酚均具有较强的还原能力。EC50是根据线性方程求出的吸光度达0.5时所需样品的总酚浓度，该值越小，表示还原力越强。根据EC50的比较，三种来源的石榴多酚还原能力强弱为：石榴渣多酚（EC50＝53.75mg/L）＞石榴皮多酚（EC50＝54.70mg/L）＞石榴汁多酚（EC50＝59.45mg/L）。

2.3 石榴多酚对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除能力

图2 石榴多酚对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除能力Fig.2 Scavenging effects of pomegranate polyphenols on Superoxide anion radical

由图2可以看出，总的来说，三种石榴多酚提取物对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除能力均随着总酚浓度的增大而增强，在总酚浓度为1～30mg/L范围内呈现良好的线性关系，进一步增大浓度则其清除率变化减小。三种石榴多酚对超氧阴离子自由基的清除能力强弱顺序为：石榴渣多酚（IC50＝14.66mg/L）＞石榴汁多酚（IC50＝18.88mg/L）＞石榴皮多酚（IC50＝22.41mg/L）。当总酚浓度达到70 mg/L时，三种石榴多酚的清除率相近，分别为石榴渣多酚 83.19%、石榴汁多酚 81.23%、石榴皮多酚 78.43%。当浓度为20mg/L时，石榴渣多酚的清除率与茶多酚相当，石榴汁多酚和石榴皮多酚的清除率要低于茶多酚，但三者清除率均明显高于BHT，为BHT的2.80～3.88倍，表明三种石榴多酚对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除能力均较强。

2.4 石榴多酚对羟自由基（·OH）的清除能力

图3 石榴多酚对羟自由基（·OH）的清除作用Fig.3 Scavenging effects of different pomegranate polyphenols on hydroxyl radical

如图3所示，在一定的浓度范围（100～500mg/L）内，石榴多酚对羟自由基的清除作用随着其浓度的增大而增强，其剂量效应关系表现为较好的直线关系，但继续增大浓度时，清除率变化减小。根据IC50值判定，三种石榴多酚清除羟自由基能力大小为：石榴汁多酚（IC50＝308.70mg/L）＞石榴渣多酚（IC50＝331.50mg/L）＞石榴皮多酚（IC50＝350.31mg/L）。在实验的最大浓度 700mg/L时，三种样品清除率差别很小，分别为：石榴皮多酚84.21%、石榴汁多酚86.27%、石榴渣多酚84.66%。当浓度均为400 mg/L时，三种石榴多酚对羟自由基的清除能力与茶多酚相近，为BHT的4.69～5.34倍，说明三种石榴多酚均具有较强的羟自由基清除能力。

2.5 石榴多酚对DPPH·的清除作用

图4 石榴多酚对DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effects of different pomegranate polyphenols on DPPH·

从图4可看出，三种石榴多酚对DPPH·均有较强的清除能力，在较低的浓度下即可达到较高的清除率；随着浓度的增大，其清除作用也增强，在1～10mg/L的浓度范围内呈现较好的量效关系。根据IC50值显示，三种石榴多酚对DPPH·的清除能力的大小为：石榴汁多酚（IC50＝3.89mg/L）＞石榴渣多酚（IC50＝4.74mg/L）＞石榴皮多酚（IC50＝5.33mg/L）。在测试的最大浓度30 mg/L时，三种样品的清除率差异不大，分别为石榴汁多酚91.98%、石榴皮多酚90.97%、石榴渣多酚88.89%。当浓度为10mg/L时，三种石榴多酚对DPPH自由基的清除能力与茶多酚相当，且明显高于BHT，为BHT的4.21～4.64倍。

2.6 石榴多酚对脂质过氧化的抑制能力

图5 石榴多酚对脂质过氧化的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of pomegranate polyphenols on peroxidation of polyunsaturated fatty acid from yelk lipoprotein induced by Fe2+

由图5可看出，三种来源的石榴多酚对Fe2+诱导的卵黄脂蛋白脂质过氧化均有较强的抑制作用，当总酚浓度小于30mg/L时，它们的抑制率随着浓度的增大而迅速增大，其量效关系呈现较好的直线相关性。从IC50判断，三种石榴多酚对脂质过氧化的抑制能力强弱为：石榴渣多酚（IC50=12.29mg/L）＞石榴汁多酚（IC50=17.66mg/L）＞石榴皮多酚（IC50=24.37mg/L）。当总酚浓度为50mg/L时，它们的抑制率很接近，但均小于茶多酚和BHT。当总酚浓度大于50mg/L时，抑制率变化不大，曲线趋于平缓，但三种样品的抑制率高低发生了变化，在测定的最大浓度200mg/L时各试样抑制率大小关系为：石榴皮多酚（82.66%）＞石榴渣多酚（81.54%）＞石榴汁多酚（79.44%）。

3 结论与讨论

石榴是一种功能价值很高的水果，近年来有关石榴多酚的研究报道较多，但大多着眼于石榴某一部位的多酚提取工艺和活性的研究，缺乏系统、全面的分析研究。本研究是在前期对石榴各部位进行多酚提取和组成研究的基础上，进一步对三种来源的石榴多酚进行了抗氧化活性的比较分析。从还原能力、清除自由基能力和抗脂质过氧化能力三个方面对石榴多酚抗氧化活性进行测定，并在自由基清除能力方面采用了三个体系：DPPH自由基体系、超氧阴离子自由基体系和羟自由基体系，较为全面地分析了石榴多酚的抗氧化能力。研究表明，石榴皮多酚、石榴汁多酚、石榴渣多酚均具有较强的体外抗氧化和清除自由基活性，且在一定范围内多酚浓度与其抗氧化能力成良好的线性关系。但三种来源的石榴多酚在不同评价体系中的抗氧化能力不具有一致性，其中石榴渣提取物的还原能力、对超氧阴离子自由基清除能力和抗脂质过氧化能力最强，而石榴汁提取物对羟自由基和 DPPH自由基清除能力最强。总体来说，在总酚质量浓度相同的情况下，石榴渣多酚和石榴汁多酚的抗氧化活性要高于石榴皮多酚，该结果与 Seeram等[13]的研究结果具有一致性。

根据前期研究和文献报道[14－18]，石榴不同部位酚类物质组成和含量存在显著差异，这可能是导致三种来源的石榴多酚抗氧化活性存在差异的主要原因。有机溶剂萃取法操作简便、快速，适合于以实验室应用为目的的多酚的纯化富集，本研究所采用的多酚提取物是通过前期所研究开发的石榴多酚有机溶剂萃取纯化富集工艺进行制备的，该工艺对于石榴皮多酚的纯化效果较好，多酚提取物纯度达到79.83%，而对于石榴渣和石榴汁多酚的纯化效果不太理想，提取物样品中一些非多酚抗氧化物质的存在，可能会对其抗氧化活性起到协同作用，从而增强其抗氧化能力[13]。多酚物质与其抗氧化活性之间的具体构效关系，还需要在对石榴多酚进行进一步的组分分离、结构鉴定等基础上进行分析。

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