低氧对人喉鳞癌Hep－2细胞凋亡的影响及其机制探讨

董凯峰，张翠红，宋冬梅，吕 欣，张继华，薛海涛，赵玉玲，牛英豪

(1河北医科大学第一医院，石家庄050031;2白求恩国际和平医院)

肿瘤发生、发展过程中，常处于缺血、低氧微环境状态。研究证实，低氧诱导因子α(HIF-1α)是调控肿瘤细胞适应低氧微环境的核心因子，可诱导多种基因表达，是参与细胞凋亡的重要因子之一［1］。近来研究表明，赖氨酰氧化酶(LOX)在不同肿瘤组织及恶性肿瘤细胞系中的表达既有上调又有下调。结果证实，LOX可能具备双重功能，即抑制或促进肿瘤转移［2，3］，目前具体作用机制尚不明确。2013年2～7月，我们观察了低氧对人喉鳞癌Hep-2细胞凋亡的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Hep-2细胞(河北医科大学第一医院耳鼻喉头颈外科冻存)，RPMI1640培养基(Gibico公司);鼠抗人HIF-1α、LOX抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，RNA提取试剂(Invitrigen公司)，cDNA合成试剂盒及扩增试剂盒(北京Trans gene公司)，上、下游引物合成(北京全式金生物公司)，凝胶成像分析系统(美国UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组与培养 将Hep-2细胞在37℃、5%CO2、20%O2环境中培养12 h，细胞进入对数生长期后随机分为常氧组及低氧组。低氧培养实验条件为 2%O2、5%CO2、93%N2、37 ℃，具体实验装置制作见参考文献［2］;常氧组原环境继续培养。24 h后收集两组细胞。每组实验重复5次。

1.2.2 细胞凋亡观察 采用流式细胞仪(FCM)。检测时随机抽取待测标本的一部分细胞，将这部分细胞作为随机样本进行分析;首先测出样本细胞总数，再测得其中凋亡细胞占该样本细胞总数的百分率，即细胞凋亡率。

1.2.3 HIF-1α、LOX 蛋白检测 采用 Western blot法。收取核蛋白及总蛋白，常规SDS-PAGE电泳，转膜，封闭;一抗4℃过夜，次日二抗孵育显色。Lab work2.0软件分析蛋白 IOD值，以 HIF-1α(LOX)与Actin的百分比表示 HIF-1α(LOX)蛋白的相对表达量。

1.2.4 HIF-1α、LOX mRNA 检测 采用 RT-PCR法。Trizol法提取总 RNA，β-actin作内参，每例样本重复5次。人HIF-1α、LOX mRNA PCR引物序列及反应条件参照文献［3］。Lab work2.0软件分析IOD值，以HIF-1α(LOX)与β-actin的百分比表示HIF-1α(LOX)mRNA的相对表达量。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。数据以±s表示，组间比较用t检验;相关关系采用Person相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞凋亡情况比较 常氧组细胞凋亡率为13.86% ±0.12%，低氧组为 5.13% ±0.67%，P＜0.05。

2.2 两组细胞中HIF-1α、LOX蛋白表达比较 低氧组细胞中HIF-1α、LOX蛋白相对表达量分别为28.34% ±0.86%、48.21% ±2.02%，常氧组分别为16.03% ±1.11%、36.21% ±1.02%，P 均 ＜0.05。见图1。低氧组细胞中HIF-1α与LOX蛋白表达呈正相关(r=0.862，P ＜0.05)。

图1 两组细胞中HIF-1α、LOX蛋白表达

2.3 两组细胞中HIF-1α、LOX mRNA表达比较低氧组细胞中HIF-1α、LOX mRNA相对表达量分别为29.12% ± 1.24%、37.32% ±0.64%，常氧组分别为21.02% ±0.21%、35.43% ±1.41%，P 均 ＜0.05。见图2。低氧组细胞中 HIF-1α与LOX mRNA 表达呈正相关(r=0.862，P ＜0.05)。

图2 两组细胞中HIF-1α、LOX mRNA表达

3 讨论

局部低氧是肿瘤微环境的一个重要特征。业已证实，HIF是调节肿瘤细胞适应低氧的关键因子。其主要在低氧条件下激活表达，是调节低氧反应性基因表达的共同通路;其可诱导多种基因表达，与肿瘤发生、发展密切相关，给肿瘤治疗带来巨大困难［4，5］。低氧微环境的肿瘤细胞具有高转移性及耐药性，导致转移性肿瘤难以治愈。HIF可在不同程度的低氧微环境下以不同形式存在，不同实验(生理或病理)条件或不同细胞中通过不同的机制对细胞发挥促凋亡或抗凋亡的作用［6～8］。本研究结果表明，低氧可以一定程度上抑制Hep-2细胞凋亡(P＜0.05)。

LOX可作用在细胞外基质(ECM)的胶原和弹性纤维并催化系列反应，最终形成胶原及弹性纤维间的共价交联［9，10］，其产生与活性在维系ECM的发育、成熟及结构完整性方面发挥重要作用［11，12］。有研究显示，LOX表达可能与人类肿瘤细胞低氧环境有关。进一步研究发现，LOX启动子为功能性的低氧反应元件，HIF-1通过这个低氧反应元件可在mRNA水平诱导LOX表达上调。一些关于头颈部肿瘤和乳腺癌患者的临床研究证实，LOX表达水平与肿瘤低氧有明确的相关性。近期研究指出，LOX由HIF-1调控，同时LOX高表达的肿瘤患者远处转移几率增大，生存率降低。还有研究表明，抑制LOX能降低乳腺癌在小鼠身上的转移几率［13～15］。

本研究结果表明，低氧能明显增加Hep-2细胞HIF-1α蛋白及其mRNA表达，同时LOX蛋白及其mRNA表达相应上调;流式细胞术结果显示，常氧组与低氧组相比Hep-2细胞凋亡率低。推测肿瘤内的低氧微环境导致HIF-1α蛋白表达上调，进而可能调控LOX蛋白表达;同时推断HIF-1α 可能通过调节LOX表达促进肿瘤的转移，在喉癌的发生、发展和浸润转移过程中发挥重要作用。提示可将HIF-1α及LOX作为治疗喉癌的一个新靶点，通过增加肿瘤的氧供来提高疗效。

［1］Shu G，Mi X，Cai J，et al.Brucine，an alkaloid from seeds of Strychnos nux-vomica Linn，represses hepatocellular carcinoma cell migration and metastasis:the role of hypoxia inducible factor 1 pathway［J］.Toxicol Lett，2013，222(2):91-101.

［2］Ping W，Jiang WY，Chen WS，et al.Expression and significance of hypoxia inducible factor-1α and lysyl oxidase in non-small cell lung cancer［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(6):3613-3618.

［3］Crucet M，Wüst SJ，Spielmann P，et al.Hypoxia enhances lipid uptake in macrophages:role of the scavenger receptors Lox1，SRA，and CD36［J］.Atherosclerosis，2013，229(1):110-117.

［4］Beerlage C，Greb J，Kretschmer D，et al.Hypoxia-inducible factor 1-regulated lysyl oxidase is involved in Staphylococcus aureus abscess formation［J］.Infect Immun，2013，81(7):2562-2573.

［5］Ji F，Wang Y，Qiu L，et al.Hypoxia inducible factor 1α-mediated LOX expression correlates with migration and invasion in epithelial ovarian cancer［J］.Int J Oncol，2013，42(5):1578-1588.

［6］Hag AM，Pedersen SF，Christoffersen C，et al.F-FDG PET imaging of murine atherosclerosis:association with gene expression of key molecular markers［J］.PLoS One，2012，7(11):e50908.

［7］Goto TM，Arima Y，Nagano O，et al.Lysyl oxidase is induced by cell density-mediated cell cycle suppression via RB-E2F1-HIF-1α axis［J］.Cell Struct Funct，2013，38(1):9-14.

［8］Luo W，Chang R，Zhong J，et al.Histone demethylase JMJD2C is acoactivator for hypoxia-inducible factor 1 that is required for breast cancer progression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(49):3367-3376.

［9］Semenza GL.Molecular mechanisms mediating metastasis of hypoxic breast cancer cells［J］.Trends Mol Med，2012，18(9):534-543.

［10］Tanaka T，Yamaguchi J，Shoji K，et al.Anthracycline inhibits recruitment of hypoxia-inducible transcription factors and suppresses tumor cell migration and cardiac angiogenic response in the host［J］.J Biol Chem，2012，287(42):34866-34882.

［11］Huang TQ，Wang Y，Ebrahem Q，et al.Deletion of HIF-1α partially rescues the abnormal hyaloid vascular system in Cited2 conditional knockout mouse eyes［J］.Mol Vis，2012(18):1260-1270.

［12］Mizuno S，Yasuo M，Bogaard HJ，et al.Copper deficiency induced emphysema is associated with focal adhesion kinase inactivation［J］.PLoS One，2012，7(1):e30678.

［13］Copple BL，Kaska S，Wentling C.Hypoxia-inducible factor activation in myeloid cells contributes to the development of liver fibrosis in cholestatic mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2012，341(2):307-316.

［14］Guadall A，Orriols M，Alcudia JF，et al.Hypoxia-induced ROS signaling is required for LOX up-regulation in endothelial cells［J］.Front Biosci(Elite Ed)，2011(3):955-967.

［15］Wong CC，Gilkes DM，Zhang H，et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a master regulator of breast cancer metastatic niche formation［J］.Proc Natl AcadSci U S A，2011，108(39):16369-16374.