大豆乳混合牛乳制备仿开菲尔发酵条件的优化

汪建明，陶 杰，贾 磊

(天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

传统开菲尔是以牛奶、羊奶为原料，由开菲尔粒或开菲尔粒中必需菌作发酵剂，发酵制得的一种富含蛋白质、维生素、酸、乙醇等及少量 CO2的营养型发酵乳[1]．其中的物质主要包括开菲尔多糖、乳酸、醋酸、脂肪酸、氨基酸、维生素、风味化合物等[2-4]．由于开菲尔营养丰富且对人体有保健功效，因此早已成为研究人员关注的热点．但是，目前国内外对于开菲尔的研究主要集中在开菲尔粒的微生物组成和传统开菲尔的工艺优化上，如国外 Witthuhn等[5]、Pogačić等[6]、Simova等[7]对于开菲尔粒及其中几种重要菌种的研究，以及国内刘慧等[8]、张慧敏等[9]对于开菲尔功能特性的研究．这些研究都是从开菲尔的发酵菌种角度出发．

本文从开菲尔的发酵原料出发，利用部分豆乳代替牛乳，根据开菲尔的特点，主要考察了牛乳与豆乳的添加比例、蔗糖添加量、发酵时间对发酵制品的影响，以获得混合乳发酵制备仿开菲尔的最佳工艺参数，从而开发符合中国消费者观念的仿开菲尔产品．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料

大豆，市售；白砂糖，上海上棠食品有限公司；脱脂乳粉，新西兰纽瑞滋有限公司；开菲尔酸奶，北京川秀国际贸易有限公司．

1.1.2 菌种

酿酒酵母(Saccharomyces cereviviscence)Y1，天津科技大学生物工程学院；保加利亚乳杆菌(Lactobacillus ssp.bulgaricus)B1、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)T5，DSM 中国有限公司．

1.2 实验方法

1.2.1 理化指标的测定

pH采用pH计测定；酸度采用滴定法[10]测定；黏度采用 DV-III＋型流变仪(Brookfield公司)测定；乙醇的含量采用气相色谱法测定．

1.2.2 感官评价方法

感官评价方法见表1．

表1 感官评分表Tab.1 Sensory evaluation of products

1.2.3 豆乳的制备及牛乳的配制

豆乳制备的工艺流程为：大豆清洗→干燥去皮→浸泡(豆水比例为 1∶3，浸泡 12,h)→磨浆→分离→灭菌→灭酶→冷却．牛乳配制中乳粉与水的比例为1∶8．

1.2.4 单因素实验

经过前期单因素实验确定混合乳制备仿开菲尔的酵母菌和乳酸菌的接种量分别是 1.0×105,mL–1和1.0×107,mL–1，最佳的发酵温度是22,℃．在本实验中固定以上条件．

(1)牛乳与豆乳比例对发酵的影响：分别配制牛乳与豆乳比例为 10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、0∶10的混合乳，加入 1.0%的蔗糖，以接种量为 1.0×105,mL–1和 1.0×107,mL–1分别接入酵母菌和乳酸菌，22,℃发酵 20,h，10,℃成熟 12,h后取样测定各发酵乳的 pH、酸度、乙醇含量，同时进行感官评定．

(2)蔗糖添加量对发酵的影响：在最佳牛乳与豆乳比例的混合乳中，分别加入 0.0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的蔗糖，以接种量为1.0×105,mL–1和1.0×107,mL–1分别接入酵母菌和乳酸菌，22,℃发酵20,h，10,℃成熟 12,h后取样测定各发酵乳的 pH、酸度、乙醇含量，同时进行感官评定．

(3)发酵时间对发酵的影响：在最佳牛乳与豆乳比例的混合乳中加入最佳添加量的蔗糖，以接种量为1.0×105,mL–1和 1.0×107,mL–1分别接入酵母菌和乳酸菌，22,℃分别发酵 12、16、18、20、22,h，10,℃成熟12,h后取样测定各发酵乳的 pH、酸度、乙醇含量，同时进行感官评定．

2 结果与讨论

2.1 牛乳与豆乳比例对仿开菲尔发酵的影响

牛乳与豆乳比例对仿开菲尔发酵的影响如图 1和图2所示．

图1 牛乳与豆乳比例对pH和酸度的影响Fig.1 Effect of the ratio of cow milk to soybean milk on pH and acidity

由图 1可知：随着豆乳比例的增加，酸度呈下降趋势，发酵纯豆乳的酸度仅为 0.32%，显著低于发酵纯牛乳(P＜0.05)．这主要是由于豆乳组成与牛乳不同，缺少乳糖，乳酸菌生长不良，产酸少，酸度不够[10].

图2 牛乳与豆乳比例对乙醇含量和感官品质的影响Fig.2 Effect of the ratio of cow milk to soybean milk on ethanol content and sensory properties

由图 2可见：当牛乳与豆乳比例为 7∶3时，发酵乳细腻，既具有豆奶清香味又不失酸奶的香味，醇香和气泡都适宜，感官品质较好，且随着牛乳比例的增加，感官评分无显著差异(P＞0.05)．这与肖琳琳等[11]用开菲尔粒生产大豆酸凝乳得到的结论相同，豆浆比例增加后，出现涩口感．综合考虑诸因素，确定牛乳与豆乳的较佳比例为7∶3．

2.2 蔗糖添加量对仿开菲尔发酵的影响

考察蔗糖添加量对仿开菲尔发酵的影响，结果如图3和图4所示．

图3 蔗糖添加量对pH和酸度的影响Fig.3 Effect of the amount of sucrose on pH and acidity

图4 蔗糖添加量对乙醇含量和感官品质的影响Fig.4 Effect of the amount of sucrose on ethanol content and sensory properties

由图3和图4可以看出：酸度随着蔗糖添加量的增大先上升后下降，当蔗糖添加量为 3.0%时达到最大；乙醇含量随着蔗糖添加量的增大而逐渐升高，当添加量为 1.0%时，发酵乳乙醇含量达 1.338,mg/g，此后无明显变化；在添加量为 1.0%时感官品质最好，随后呈下降趋势，因此确定蔗糖的较佳添加量为1.0%．

2.3 发酵时间对仿开菲尔发酵的影响

不同发酵时间对仿开菲尔发酵的影响如图 5和图6所示．

图5 发酵时间对pH和酸度的影响Fig.5 Effect of fermentation time on pH and acidity

图6 发酵时间对乙醇含量和感官品质的影响Fig.6 Effect of fermentation time on ethanol content and sensory properties

由图 5和图 6可以看出：当发酵温度为 22,℃时，酸度和乙醇含量随着发酵时间的延长而逐渐增加，发酵 22,h时达最高值，酸度和乙醇含量分别为0.78%和 1.837,mg/g；而感官评分呈现出先升高后下降的趋势，16,h时发酵乳感官品质较好．刘慧等[12]研究开菲尔酸奶最佳发酵条件时同样发现，若发酵时间过长，会导致产品酸度过高，产生刺激性酸味；若发酵时间过短，发酵不充分，酸度、酒精度较低，且保加利亚乳杆菌产酸较慢；但发酵时间过长，酸度过高，且酵母产生的 CO2过多，适量 CO2的存在可以给产品带来特有的杀口感，但是过量的 CO2与乙醇等混合就会产生苦涩味．因此，最终将混合乳发酵时间确定为16,h．

2.4 开菲尔发酵的主要影响因素的确立

本研究首先进行单因素实验，确定了发酵条件(牛乳与豆乳比例为 7∶3，酵母菌接种量为1.0×105,mL–1，乳酸菌接种量为 1.0×107,mL–1，蔗糖添加量为1.0%，发酵温度为22,℃，发酵时间为16,h)的大致变化范围，然后进行适当的扩充而成为自变量的取值范围．各因素的水平和编码见表2．

表2 26-2部分析因设计因素水平表Tab.2 Factor levels of 26-2 fractional factorial design

26-2部分析因设计需要 16次实验，为估计实验误差和检测弯曲效应，在因子中心点处增加 6次重复，共需22次实验，其设计和结果见表3．

表3 26-2部分析因设计及响应值Tab.3 Experimental results and 26-2 fractional factorial design

根据表 3的数据，利用 Design-Expert 7.0软件对部分析因实验结果进行分析，得到回归模型方差分析见表4．

表4 回归模型方差分析Tab.4 Analysis of variances of the regression model

由表 4可知：本实验所得的拟合回归方程达到显著水平(模型的 P＜0.000,1)．该模型的决定系数R2＝0.849,4，说明近 85%的实验数据变异性可用此模型解释，表明回归模型与实际的拟合度比较好．弯曲的P值为0.093,7，表示响应面没有显著的弯曲，说明探索范围未接近最大响应面区域．模型回归方程系数显著性检验见表5．

表5 回归方程系数显著性检验表Tab.5 Significance test of the regression coefficients

由表 5可知，在实验设计的水平范围内，X4(蔗糖添加量)和 X6(发酵时间)对开菲尔品质均有显著影响(P＜0.05)，且均达到极显著水平(P＜0.01)，二者的系数均为正，说明增加蔗糖含量和延长发酵时间对开菲尔品质有积极的影响．而 X1(牛乳与豆乳比例)、X2(酵母菌接种量)、X3(乳酸菌接种量)、X5(发酵温度)均无显著影响(P＞0.05)，可在后续响应面设计中固定为中心点水平．因此，影响仿开菲尔发酵的主要影响因子为蔗糖添加量和发酵时间．回归得到的多元一次方程为 Y＝84.31＋1.13,X4＋2.84,X6．式中：Y为感官评分的预测值；X4＝(蔗糖添加量－1.0)/0.5；X6＝(发酵时间－16)/2．

2.5 最陡爬坡路径的确立

为了确定响应变量 Y值所接近的最大响应值区域，即取得最佳感官评分时的蔗糖添加量和发酵时间的取值范围，设计最陡爬坡实验，最陡爬坡设计和结果见表 6．感官评分在点(β4＝1.6，β6＝22)，即在原点+3,Δ 时达到最大值．故以点(β4＝1.6，β6＝22)作为下步实验的中心点．

表6 最陡爬坡法实验Tab.6 Steepest ascent experiment

2.6 发酵条件的优化

采用 Design-Expert 7.0软件生成的中心复合设计，取 4个星点(α＝±1.414)和 5次中心点实验．实验设计和结果见表 7，方差分析和模型系数显著性检验见表8．

表7 中心复合设计及实验结果Tab.7 Central composite design and results

表8 二阶回归模型方差分析Tab.8 Analysis of variances of the second-order regression model

对表 7中实验数据进行响应面回归分析可得到二阶拟合模型：Y＝92.84＋0.35,X4＋0.15,X6＋0.90,X4,X6－2.70－2.53．根据回归分析结果绘响应面图，如图 7所示．由于该方程的二次项系数均为负数，所以方程代表的抛物面的开口向下，因而有极大值点．

图7 响应曲面图Fig.7 Response surface plot

由图7可以看出，在蔗糖添加量(X4)为高水平或低水平时，随着发酵时间的延长，仿开菲尔的感官评分提高，但当发酵时间(X6)过长时，对于仿开菲尔的品质又有不利影响，这与单因素实验结果相吻合．

进一步用 Design-Expert 7.0软件对实验模型进行典型性分析，以获得最优的发酵条件．经分析得，在 X4＝0.07、X6＝0.04，即在蔗糖添加量为 1.61%、发酵时间为22.09,h时得到仿开菲尔的品质最好，感官评分为92.9．产品色泽鲜亮，呈略带微黄的乳白色；口感柔和细腻，无涩口感；仿开菲尔均匀不分层，无杂质且具有协调的酸豆奶发酵味及酵母发酵醇香气.

为了验证响应面法的可行性，采用得到的最佳发酵条件进行实验，同时考虑到实际操作和生产的便利性，将发酵条件修正为蔗糖添加量为 1.6%、发酵时间为 22,h．3次平行实验得到的实际感官评分为 92.2，所得实验值与预测值接近，二者的良好拟合性证实了模型的有效性．在最佳优化条件下，对仿开菲尔发酵产品进行理化指标的测定，并与市售开菲尔进行对比，结果见表9．

表9 理化指标比较Tab.9 Comparison of chemical properties

由表 9可知：市售牛乳开菲尔的 pH、酸度分别为 4.15、0.92%；而本研究所得产品的 pH、酸度分别为 4.32、0.78%，与市售牛乳开菲尔存在显著差异(P＜0.05)．这主要是由于豆乳中能被乳酸菌发酵的糖类较少，故产酸相对较少．本研究所得产品的乙醇含量较高，达 1.398,mg/g，而市售开菲尔的黏度略高(3.009,Pa·s)，但与本实验产品差异并不显著(P＞0.05). 通过感官分析结果可知，本研究所得产品与市售牛乳开菲尔相比，口感更加柔和细腻、酸甜更加适宜、香气协调，改善了牛乳开菲尔的风味．

因此，优化后的仿开菲尔发酵条件为：牛乳与豆乳比例 7∶3，蔗糖添加量 1.6%，发酵温度 22,℃，发酵时间22,h．

3 结 论

采用单因素和响应面相结合的方式，在前期单因素实验确定混合乳制备仿开菲尔的酵母菌和乳酸菌的接种量分别为 1.0×105,mL–1和 1.0×107,mL–1，最佳的发酵温度为 22,℃的条件下，通过单因素实验和中心复合设计实验优化混合乳发酵制备仿开菲尔的最佳工艺条件：牛乳与豆乳的添加比例为 7∶3，蔗糖添加量为 1.6%，发酵时间为 22,h．经过多次实验验证，此优化得到的条件是混合乳发酵制备仿开菲尔的最优条件．在此条件下仿开菲尔发酵产品的 pH为4.32，酸度为 0.73%，乙醇含量为 1.398,mg/g，黏度为2.990,Pa·s．进行感官评价，该产品色泽鲜亮，呈略带微黄的乳白色；口感柔和细腻，无涩口感；仿开菲尔均匀不分层，无杂质且具有协调的酸豆奶发酵味及酵母发酵醇香气．与市售开菲尔产品感官对比，所得产品质地细腻、酸度适宜、香气协调，改善了传统开菲尔的风味，更适宜我国消费者．

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