酵母多糖的提纯及化学组成

周传兵，徐泽平，刘结磊，韩晓阳，冯文娟

（山东京博控股股份有限公司，山东滨州256500）

酵母多糖提取原料为啤酒废酵母或面包酵母，目前全世界的酵母产量超过250万t，很多酵母除了用于发酵面包等还用于提取酵母抽提物，剩下的酵母细胞壁一般作为饲料用，经济附加值较低[1]。酵母多糖是酵母细胞壁的重要组成部分，其主要成分为大分子及糖蛋白复合物，酵母多糖占酵母细胞壁干重的40%左右，酵母多糖的开发可大大提高啤酒废酵母的产品附加值[2]。1961年，由Riggi确定了酵母多糖中具有生物活性的物质是葡聚糖,该发现开创了葡聚糖作为免疫活性物质研究的新纪元[3]。酵母β-葡聚糖是一种活性强、无毒副作用的高效生物应答物，具有抗肿瘤、增强机体免疫力、抗菌抗病毒等功能，已广泛用于医药、食品行业[4]。酵母细胞壁甘露聚糖能够提高动物免疫力和调节肠道菌群平衡并具有抗辐射、抗氧化等活性功能[5-6]。本实验采用碱法提取，通过微滤和超滤膜、大孔树脂吸附等分离纯化技术得到碱提多糖和酵母葡聚糖。并对提取原料和所得样品进行了脂质、蛋白、总糖含量的分析，采用HPLC对两种多糖的单糖组成进行了分析。为酵母多糖的提取、纯化、成分分析及应用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

啤酒酵母粉：唐山拓扑生物科技有限公司；单糖标品：葡萄糖、甘露糖（sigma）三氟乙酸、氢氧化钠、正己烷等均为分析纯。

1.2 仪器设备

陶瓷微滤膜设备、超滤膜设备：合肥世杰膜设备有限公司；UV-1700紫外可见分光光度计：日本岛津公司；高效液相色谱：SHIMADZU；蒸发光检测器；色谱柱为suagr pak-1（waters公司）；小型喷雾干燥设备：山东奥诺能源科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母多糖的提取、分离、纯化

称取一定量的啤酒酵母粉，加入10倍重量的1 mol/L氢氧化钠溶液，80℃，搅拌提取2 h，离心，上清液用冰乙酸中和后利用0.2 μm陶瓷膜微滤设备去除一些胶质及细小不溶物，然后用截留分子量10 000 u的有机超滤膜设备对微滤透析液进行浓缩、脱盐，然后利用大孔吸附树脂对浓缩液进行脱蛋白、脱色，超滤浓缩液喷雾干燥得酵母碱提多糖。离心沉淀水洗两次，离心，沉淀加10倍水，然后用乙酸调pH至3.0，加热至60℃，搅拌1 h，离心，蒸馏水洗涤沉淀2次后喷雾干燥得酵母葡聚糖。

1.3.2 脂肪含量测定

取酵母粉和碱提多糖及酵母葡聚糖各10 g，加入160 mL正己烷和40 mL甲醇混匀，加热回流抽提2 h，冷却至40℃，然后将混合物过滤，并分别用正己烷、甲醇、乙醚洗涤滤渣，将滤液蒸干得油状物，称重。

1.3.3 蛋白含量测定

蛋白质检测采用凯氏定氮法[7]。

1.3.4 总糖含量测定

采用苯酚硫酸法[8]。

1.3.5 HPLC分析单糖组成

1.3.5.1 酵母多糖的水解

分别称取碱提酵母多糖和不溶葡聚糖两种酵母多糖0.5 g，加2 mol/L三氟乙酸5 mL，安瓿瓶内封管水解，水解温度110℃，水解时间6 h。然后旋转蒸发去除三氟乙酸，加乙醇多次将三氟乙酸带出。少量水洗出后冻干，备用。

1.3.5.2 色谱条件

色谱柱：waters sugar－pak1，蒸发光检测器，柱温80℃，流动相纯水，流速0.6 mL/min。

1.3.5.3 实验方法

标准单糖溶液及酵母多糖水解样品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，吸取15 μL用于液相分析。对比酵母多糖水解液和单糖标准品色谱图，确定单糖种类。

2 结果与分析

2.1 多糖提取收率及组成成分

喷雾干燥所得碱提多糖为白色粉末，酵母葡聚糖为淡黄色粉末，收率和总糖、蛋白及脂肪的含量见表1。

表1 原料和多糖成分及多糖收率Table 1 The composition of raw material and polysaccharides%

喷雾干燥后碱提多糖和葡聚糖的总糖含量分别为84.39%和92.46%，总糖含量较高。提取所得两种多糖蛋白含量分别为2.17%和1.66%，与酵母粉相比蛋白含量大幅降低。两种多糖的脂肪含量也有所降低，因此采用膜分离结合大孔吸附树脂对多糖分离纯化可以获得较高纯度的多糖。

2.2 HPLC分析结果

HPLC分析结果见图1～图4。

图1 甘露糖标准品HPLCFig.1 HPLC chromatogram of mannose standard

图2 葡萄糖标品HPLCFig.2 HPLC chromatogram of glucose standard

图3 酵母葡聚糖水解液HPLCFig.3 HPLC chromatogram of hydrolysis glucan liquid

图4 碱提多糖水解液HPLCFig.4 HPLC chromatogram of hydrolysis alkali soluble polysaccharide liquid

根据多糖水解液色谱峰和标准品保留时间可知（见图1～3），酵母碱提多糖水解液保留时间8.841 min的色谱峰为甘露糖，7.848 min的峰为葡萄糖峰，3.909 min的色谱峰为未完全水解的多糖。酵母葡聚糖水解液保留时间7.833 min的色谱峰为葡萄糖，3.851 min的色谱峰为未完全水解的多糖。由此可知酵母碱提多糖成分为甘露聚糖，含有的及少量的葡萄糖可能是提取过程水解的葡聚糖。酵母葡聚糖成分较纯，甘露聚糖已经除尽。

3 结论

1）采用碱提取以及微滤、超滤、大孔树脂吸附等纯化工艺可以得到纯度较高的甘露聚糖和酵母葡聚糖。酵母葡聚糖中不含甘露聚糖和其他杂糖，葡聚糖糖含量为92.46%，蛋白含量为1.66%。试验中采用的膜分离和大孔吸附树脂对多糖进行分离纯化，喷雾干燥设备干燥的工艺过程中无有机溶剂的使用，操作简单，适合规模化生产。

2）本研究采用HPLC分析单糖组成，使用sugarpak1色谱柱、蒸发光检测器得到了很好地分离和检测结果。因此该方法可以作为酵母多糖单糖组成的分析方法，弥补了苯酚硫酸法测定总糖而无法分析单糖组成的不足。

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