泸州地区龙眼核中总黄酮提取工艺研究

王俊，王芳，傅秀娟，彭艺飞

（泸州医学院药学院，四川泸州646000）

龙眼为无患子科（Sapindaceae）龙眼属（Dimocarpus Lour.）常绿果树，乔木。龙眼营养价值很高，也是重要的药材之一，龙眼壳、龙眼核、龙眼花和龙眼皮、根均可以作为配伍的中药[1]。龙眼核性味涩、平，气微，味淡而微苦，具有止血、定痛、理气化湿等功效，用于治疗创伤出血、疝气、疥癣、湿疮等，并有开胃健脾，补虚益智的功效。桂圆肉可以治疗虚劳赢弱，失眠健忘，惊悸怔忡以及脾虚泄泻，产后水肿等症[2]。龙眼核的重量占龙眼果实鲜重的1/3，由于没有很好地综合利用，大多作为废弃物丢弃，造成了浪费和环境污染。在龙眼核中总黄酮的含量较高，研究发现黄酮类化合物对心脑血管损伤、肝损伤、心律失常等具有调节作用，同时还具有抗自由基和抗肿瘤活性[2]。为探讨超声波乙醇浸提法和乙醇回流法提取龙眼核总黄酮的实验条件及效果，研究了各种因素对提取率的影响，同时通过正交法对龙眼核药用成分的提取工艺进行了较全面的探索，确定了龙眼核总黄酮量超声提取的最佳工艺[3－4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药材

龙眼核：购于泸州市场。

1.1.2 主要仪器

UV1700PC紫外可见分光光度计：上海凤凰光学科仪有限公司；AS3120A超声波清洗器、真空泵：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HH－W三用恒温水箱：江苏省金坛市医疗仪器厂；架盘药物天平BP－Ⅱ型：上海医用激光仪器厂。

1.1.3 主要试剂

95%乙醇AR；亚硝酸钠AR；硝酸铝AR；氢氧化钠AR；芦丁对照品（批号：100080－200306，中国药品生物制品检定所）。

1.2 方法

1.2.1 龙眼核中总黄酮的提取

1.2.1.1 超声提取

精密称取9份5.000 g研细的龙眼核粉末，置于250 mL磨口锥形瓶内，按料液比加入一定浓度的乙醇，分别按L9（34）正交设计方法进行提取，抽滤，抽滤时用30%乙醇溶液少量频繁的洗涤药渣。将滤液用体积相近的容量瓶定容；并用紫外可见分光光度计测定其总黄酮的含量。正交试验的因素和水平见表1。

表1 正交试验的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthoganal test

1.2.1.2 回流提取

精密称取16份5.000 g研细的龙眼核粉末，置于250 mL圆底烧瓶。按料液比加入一定浓度乙醇溶液回流提取。将各组处理进行抽滤，将滤液用适当容量瓶分别定容；用紫外可见分光光度计测定其总黄酮的含量。并且通过单因素试验考察不同因素对总黄酮含量的影响。

①不同回流时间对总黄酮含量的影响。固定料液比为 1∶11（W/V，下同），提取 3 次，选择回流时间分别为 0.5、1、1.5、2、3 和 4 h 进行试验，考察不同回流时间对总黄酮含量的影响。②不同料液比对总黄酮含量的影响。固定回流时间为3 h，回流提取3次，选择料液比分别为 1∶7、1∶9、1∶11、1∶13 和 1∶15 进行试验，考察不同料液比对总黄酮含量的影响。③不同回流次数对总黄酮含量的影响。固定料液比为1∶11，回流时间为3 h，选择回流提取次数分别为1、2、3、4和5次进行试验，考察不同回流次数对总黄酮含量的影响。

1.2.2 总黄酮的测定[5]

1.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取10 mg烘干至恒重的芦丁对照品，用30%乙醇溶液溶解并定容至100 mL，得0.10 mg/mL的芦丁对照液。分别精密吸取0.10 mg/mL的芦丁对照液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，分别加入10%亚硝酸钠溶液0.50 mL，摇匀，静置6 min；再加入10%硝酸铝溶液0.50 mL，摇匀，静置6 min；再加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置12min，以30%乙醇作为空白液，于510 nm处测吸光度。吸光度测量结果见表2。以浓度对吸光度回归，得回归方程 A=12.272C+0.016 3；r=0.996 9，结果表明，浓度在0.05 mg/mL～0.49 mg/mL范围内，浓度与吸光度线性关系良好。

表2 紫外可见分光光度法测定芦丁对照液的吸光度Table 2 Determining the absorbance by using UV spectrophotometric method

1.2.2.2 样品中总黄酮的测定

精密吸取样品液0.50 mL于10 mL容量瓶中，按照1.2.2.1方法测其吸光度A，根据标准曲线计算总黄酮的含量。

1.2.3 超声法和回流法最佳工艺的验证试验

分别选择超声法的最佳工艺即乙醇浓度60%，超声3次，每次10 min，料液比1∶11；回流法的最佳工艺即回流3次，料液比 1∶11，回流3 h，平行3组进行验证试验，计算黄酮提取率。

2 结果与分析

2.1 正交试验及验证试验

2.1.1 正交试验

采用紫外分光光度法对9份样品中总黄酮的含量进行测定，正交试验及方差分析见表3、表4。

表3直观分析结果表明，各因素对提取黄酮的影响程度大小为：料液比＞乙醇浓度＞超声次数＞超声时间。由表4方差分析结果可知：料液比和乙醇浓度对总黄酮提取率的影响达到了显著水平，是提取总黄酮的主要影响因素。正交试验中A2B3C2D1为最优水平组合，因此确定乙醇浓度60%，超声次数3次，料液比1∶11，每次10 min作为总黄酮提取的最佳工艺。

表3 正交试验结果Table 3 The results of the orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.1.2 验证试验

精密称取3份5.000 g研细的龙眼核粉末，置于250 mL磨口锥形瓶内，按照上述优选提取工艺进行验证，结果三批龙眼核总黄酮提取率稳定，平均提取率为2.795%，结果见表5。

表5 总黄酮提取验证试验Table 5 Demonstration test of the extraction of total flavonoids

2.2 回流法单因素试验

2.2.1 回流时间对总黄酮提取率的影响

回流时间对总黄酮提取率的影响见图1。

由图1可知，随着提取时间的增加龙眼核中黄酮的提取率逐渐增加，提取时间超过3 h后，总黄酮的提取率随回流时间的增加增幅变缓，考虑到生产周期和设备的利用率，确定回流时间以3 h为宜。

2.2.2 料液比对总黄酮提取率的影响

料液比对总黄酮提取率的影响见图2。

图1 回流时间对总黄酮提取率的影响Fig.1 The effect of reflux time on the extraction rate of total flavonoids

图2 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

由图2可知，当料液比为1：11时，龙眼核中总黄酮的提取率最高，因此确定料液比为1∶11。

2.2.3 回流次数对总黄酮提取率的影响

回流次数对总黄酮提取率的影响见图3。

图3 回流次数对总黄酮提取率的影响Fig.3 The effect of reflux times on the extraction rate of total flavonoids

由图3可知，当提取3次时，龙眼核中总黄酮的提取率最高，因此确定回流次数为3次。

2.3 超声法和回流法最佳工艺的比较

超声法和回流法的提取率见表6，由表6可知，采用超声法提取龙眼核中总黄酮其平均提取率为2.795%，而采用回流提取法其平均提取率为2.394%，表明超声提取更方便，有效，安全。故超声法优于回流提取法。

表6 不同提取方法结果Table 6 The test results by different extraction methods

3 结论与讨论

文中对比了回流法和超声法在龙眼核总黄酮提取工艺中的差异，目的在于确定一种较优的提取工艺。

1）以芦丁为对照品测定龙眼核中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时用氢氧化钠溶液控制其pH，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在510 nm处能获得稳定的特征吸收峰。

2）提取液应趁热抽滤，以防止乙醇挥发，在试验中应用保鲜膜封住装有乙醇的容器，所以操作应当仔细，减少误差。

3）用回流法提取龙眼核中总黄酮，应选择的是索式提取器，方便提取操作的顺利进行。

4）通过两种提取方法得到的结果来看，超声法提取较回流法有更高的提取率。应用该法工艺设备简单，操作方便，提取时间短，是一条较为理想的方法，最佳工艺为以11倍量的60%乙醇超声提取3次，每次10 min，最佳提取率为2.795%。

[1] 蔡长河,唐小浪,张爱玉.龙眼果肉的食疗价值及其开发应用前景[J].食品科学,2002(8):328-330

[2] 黄河胜,马传庚,陈志武.黄酮类化合物药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2000(10):589-592

[3] 贤景春,陈美赢.超声提取龙眼核总黄酮量的工艺[J].食品研究与开发,2010(4):5-7

[4] 陆海峰,赵进,李琳.超声波提取龙眼叶总黄酮及其鉴别[J].微量元素与健康研究,2007(4):48-49

[5] 陈丛瑾,黄克瀛,李姣娟.植物中黄酮含量的光学测定方法研究进展[J].光谱实验室,2007(4):524-530