全自动SPE-HPLC法测定食品中丙酸钙（钠）和双乙酸钠

向文娟，王吉祥，冯雷，马雪涛，珠娜

（云南省产品质量监督检验研究院国家热带农副产品质量监督检验中心，云南昆明650223）

丙酸钙是世界卫生组织（WHO）和联合国粮农组织（FAO）批准使用的安全可靠的食品与饲料用防霉剂；双乙酸钠是一种多功能的食用化学品，主要用作食品和饲料工业的防腐剂、防霉剂、螯合剂、调味剂、pH调节剂、肉制品保存剂，也是复合型防霉剂的主要原料。现代食品工业中，常常在面包和豆制品以及糕点中添加丙酸钙（钠）和双乙酸钠作为防腐剂，可以有效地抑制霉菌、黄曲霉毒素的生长，延长产品的保质期。但是过量的食用会导致肠胃烧伤[1]，造成中毒甚至死亡，对儿童、孕妇等特殊人群危害更大[2]。我国卫生部在GB 2760－2011《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中规定丙酸钙（钠）可以在面包、糕点、酱油等食品中作为添加剂使用，最大使用量为2.5 g/kg，双乙酸钠的最大使用量是4.0 g/kg[3]。

在对食品中丙酸钙（钠）和双乙酸钠的检测方法上，我国制定了国家标准，主要是蒸馏法和直接浸提法[4－5]，但蒸馏法由于检测灵敏度和回收率都较低，样品处理复杂，效率低，不易大批量的处理样品；而采用直接浸提法大部分食品的水提取物成分复杂干扰严重，在色谱分析过程中造成基线抬升，灵敏度下降，且频繁出现鬼峰，严重影响分析结果。采用固相萃取作为样品前处理方法具有高效、稳定、准确定量、实现快速和自动化等优势，可以有效降低复杂样品中的基质干扰，提高样品测定准确度和灵敏度[6－7]。本文通过研究，对不同固相萃取条件进行优化，建立Cleanert SAX强阴离子交换固相萃取的前处理方法，并采用Gilson公司的全自动固相萃取仪进行实验，极大的提高工作效率和实验的重现性，从而在利用高效液相色谱进行分析时有效降低基质干扰，提高检测灵敏度，保证检测结果的准确可靠。

1 材料与方法

1.1 仪器

岛津高效液相色谱系统（HPLC仪）：低压梯度泵（LC－20AT）、在线真空脱气机（DGU－20A5）、紫外检测器（SPD－20A）、自动进样器（SIL－20A）、柱温箱（CTO－20A）和岛津液相色谱工作站（Lab solution）。Milli－Q 纯水系统：美国M illipore公司；GX－274 ASPECTM吉尔森固相萃取仪：美国Gilson。

1.2 试剂与材料

磷酸氢二铵：AR级，中国成都化学试剂厂；丙酸钙、双乙酸钠：德国SAFC公司；实验室用超纯水（18.2 MΩ）均来自Milli－Q纯水系统；Cleanert SAX强阴离子交换固相萃取小柱：500 mg/6 mL美国Agela公司。

丙酸钙（以丙酸计）、双乙酸钠（以双乙酸钠计）混合标准贮备液的配制（10.0 mg/mL）：准确称取1.26g丙酸钙（精确至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中（相当于10.0 mg/mL丙酸），准确称取1.00 g双乙酸钠（精确至0.000 1 g），用水溶解并定容至刻度。

流动相（1.5 g/L的磷酸氢二铵溶液）：称取磷酸氢二铵1.5 g，加水溶解并定容至1 000 mL，用1 mol/L的磷酸溶液调节pH至3.0～3.5，过0.45 μm滤膜。

1.3 样品前处理方法

称取5.000 g（精确至0.001 g）的样品至25 mL比色管中，用超纯水定容至刻度，浸泡过夜（或超声提取1 h）后，滤出液体，用5%的氨水调pH至碱性，待过吉尔森全自动固相萃取仪。

固相萃取条件：先将Cleanert SAX强阴离子交换柱依次用5 mL甲醇、水活化后，取上述样品提取液1 mL，以2 mL纯水淋洗，弃去淋洗液，用2 mL洗脱液进行洗脱并收集洗脱液，过0.45 μm滤膜，供HPLC分析。

1.4 色谱条件

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES 5u（250 mm×4.6 mm id.）；柱温：35 ℃；紫外检测波长 214 nm；流动相：1.5 g/L 的磷酸氢二铵溶液（pH3.0～3.5）；流速：1.0 mL/min；进样体积 5.0 μL。

1.5 标准曲线绘制

分别准确吸取 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mL 的标准贮备液（1.2）于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制成浓度分别为 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL 的混合标准系列溶液。

2 结果与分析

2.1 固相萃取条件的优化结果

2.1.1 固相萃取柱的选择

因丙酸钙（钠）及双乙酸钠在酸性溶液中解离为丙酸和乙酸，均为弱酸，因此分别使用Waters Oasis MAX混合离子固相萃取柱、Cleanert SAX强阴离子固相萃取柱和C18固相萃取柱对同一样品中的丙酸和双乙酸钠回收率作比较，结果见表1。

表1 不同固相萃取小柱对样品中丙酸和双乙酸钠回收率比较Table 1 The comparison of recoveries by different SPE column%

结果表明在相同条件下，Cleanert SAX固相萃取小柱的回收率最高，可达90%以上，说明强阴离子固相萃取柱对于弱酸性物质的净化效果最好。

2.1.2 洗脱液的浓度与体积的确定

本实验前期分别用同浓度的磷酸溶液和盐酸溶液进行洗脱对比，发现盐酸的洗脱效率明显高于磷酸溶液。后分别用6%、8%、10%的盐酸作为洗脱液，洗脱体积分别为1.0、2.0 mL时的回收率见表2。结果发现用2.0 mL 10%的盐酸洗脱回收率最高，洗脱时，洗脱速度保留在1 mL/min。

表2 不同浓度洗脱液及洗脱体积的回收率比较Table 2 The comparison of recoveries of different elution liquid and elution volume

2.1.3 方法的精密度和检出限

在空白样品中添加丙酸及双乙酸钠标准物质，添加水平为2.0 g/kg，经Cleanert SAX固相萃取柱净化，用2 mL 10%HCl洗脱过滤膜后经HPLC分析，做5个平行样，记录峰面积及保留时间。根据5次测定结果的峰面积计算出双乙酸钠和丙酸的含量，并计算相对标准偏差。结果见表3。保留时间的标准偏差为0.05%。以3倍的信噪比计算检出限，最低检出限浓度可达0.03 mg/kg。由表3可以看出，双乙酸钠含量相对标准偏差为1.47%，丙酸含量相对标准偏差为1.32%（n=5）。

表3 试样测定的精密度及回收率实验结果（n=5）Table 3 The resluts of precision and recoveries in detection of sample（n=5）

2.2 与国标直接浸提法的比较研究

将同一样品经加标后，分别直接用水浸提和浸提后过Cleanert SAX固相萃取柱（以下称过柱法），上液相色谱仪得出色谱图，见图1。其中虚线为直接浸提法得出的图谱，实线为过柱法得出的图谱。

由图1可以看出，直接浸提法后的色谱峰出现鬼峰，且杂质干扰较多。而过柱后的色谱峰峰形较好，基质干扰较少。

2.3 与国标蒸馏法的比较研究

将同一样品经加标后，分别用国标蒸馏法和浸提后过Cleanert SAX固相萃取柱的方法，得出溶液上液相色谱仪得出色谱图，见图2。其中虚线为国标蒸馏法得出的图谱，实线为过柱法得出的图谱。

图2 过柱法与蒸馏法的比较色谱图Fig.2 Chromatogram of compared with SPE and distillated

由图2可以看出，蒸馏法得出的色谱图较为干净，杂质干扰也少，但是与过柱法比较，则回收率明显较低，且检出限较高，检测结果不如过柱法的精确度高。

3 结论

本实验应用Cleanert SAX固相萃取柱对食品样品进行净化处理后经HPLC测定食品中的丙酸钙（钠）和双乙酸钠，回收率在90%以上，最低检出限可达0.03 mg/kg，相对标准偏差小于5%。而国标蒸馏法的回收率最高只能达到70%左右，丙酸钙（钠）的检出限为0.03 g/kg，双乙酸钠的检出限为0.015 g/kg，同时减少了国标蒸馏法中搭建蒸馏装置繁琐的程序，降低了实验室使用明火的风险，提高了方法的回收率和灵敏度。利用Cleanert SAX强阴离子交换固相萃取柱，对丙酸和乙酸等弱酸有较好的净化提取效果。有效地去除了国标法中直接浸提后杂质的干扰，加上利用Gilson全自动固相萃取仪，不仅方便，快捷，而且方法的精密度和准确度相对于国标法都大大提高，同时提高了方法的重现性和工作效率。

[1] 赵天华.化学试剂化学药品手册[M].2版.北京：化学工业出版社,2006：223

[2] 王娟,高秋菊,修丽华,等.离子色谱法对食品种丙酸钙的测定[C].杭州:第十一届全国色谱学术报告会论文集,2006:134-136

[3]中华人民共和国卫生部.GB 2760-2011食品安全国家标准 食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2011：7-8

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23382-2009食品中丙酸钠、丙酸钙的测定高效液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2009:1-3

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23383-2009食品中双乙酸钠的测定高效液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2009：1-3

[6] 张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006,18(1):56-58

[7] 李小平,姚浔平,陈晓红,等.有机酸检测的固相萃取方法研究[J].中国卫生检验杂志,2007,19(8):115-118