鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

冯永胜 衣服德 （山东省青岛市畜牧兽医研究所 266100）陈正平 （青岛市崂山区沙子口街道畜牧兽医站）

鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

冯永胜 衣服德 （山东省青岛市畜牧兽医研究所 266100）陈正平 （青岛市崂山区沙子口街道畜牧兽医站）

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种以肝脏出血性炎症为特征的急性烈性传染病。该病在许多国家广泛传播，使养鸭业遭受重大损失。近年来，在许多地区时有发生，严重影响了养鸭业的发展。为了有效控制该病的发生和流行，笔者从患病鸭群中分离了DHV分离株，并进行了初步的鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料 DHVI型标准阳性血清购自中国兽医药品监察所；9～11日龄SPF鸡胚购山东省家禽研究所；11～12日龄非免疫鸭胚购自潍坊某孵化场；4日龄雏鸭购自潍坊某种鸭场。

1.2 病料的采集 将DVH病鸭无菌采集肝脏。接种普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板，分别在37 ℃恒温箱培养24h。观察有无细菌生长。将病料研碎，与灭菌生理盐水按照1:5混匀，然后加入终浓度为1000U/ml的青霉素和链霉素，于4℃冰箱中过夜。3000r/min离心10min，取上清液，-20℃保存备用。

1.3 病毒的分离与培养 将病料上清液经尿囊腔接种11～12日龄非免疫鸭胚各20只(0.2ml/枚)，于37.5℃温箱内培养。弃去24h内死亡的鸭胚，以后每隔12h观察1次，收集死亡鸭胚的尿囊液，观察鸭胚病变。按同样的方法，将病毒连续盲传5代。

1.4 RT-PCR检测 参照GenBank中发表的DHV VP1基因序列设计1对引物，引物由上海捷瑞公司合成。按照TRIzol试剂(Invitrogen公司)说明，用SDS-蛋白酶K法提取病毒RNA。反转录后，以反转录产物为模板进行PCR扩增。取10.0μl反应产物于10g/L琼脂糖中进行电泳分析。

1.5 血清学特性观察 取一定量的DHV分离株按1:2、1:20、1:200和1:2000倍稀释，加入等体积的I型DHV标准阳性血清，并加入终浓度均为100 U/ml的青霉素和链霉素。于37℃温箱作用60min后，接种11～12日龄鸭胚各10枚(0.2ml/只)。另取5枚鸭胚经尿囊腔接种0.1ml DHV病毒液作为阳性对照，另取5枚不接种作为空白对照。相同条件下培养，连续观察7d。

1.6 毒力测定 将DHV分离株进行1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106稀释，接种11～12日龄鸭胚各10枚(0.2ml/只)。同时设空白对照组。接种后，弃去24h内死亡的鸭胚，每天观察鸭胚的死亡情况，连续观察6d。按Reed-Muench法计算ELD50。

1.7 动物回归试验 选择50只4日龄雏鸭，随机分为5组，每组10只。将病料接种雏鸭，腿部肌肉注射，0.2 ml/只。对照组雏鸭注射相同剂量的生理盐水。观察并记录雏鸭的临床表现和死亡情况。

2 结果

2.1 病毒分离 病料接种在11～12日龄鸭胚传5代后，基本稳定在48～96h胚胎死亡，死亡率可达90%以上（鸭胚传代死亡情况见表1）。死亡鸭胚发育受阻，全身皮肤和皮下充血和出血，腹部和后肢严重水肿，肝呈黄红色，肿大，并有针头大小出血点和坏死灶。该病毒株对鸭胚ELD50按照毒力测定方法测定结果为105.33。

表1 DHV分离株各代次鸭胚不同死亡时间的死亡率

2.2 RT-PCR检测结果 DVH病鸭肝脏中提取RNA，采用RT-PCR方法扩增出0.5kbp大小的片段，与预期大小一致。采用RT-PCR方法检测鸭胚尿囊液中是否有禽呼肠孤病毒、禽淋巴细胞白血病病毒等，结果均为阴性。接种鸡胚比正常鸡胚小，孵至21日龄后仍不能出壳而出现死胚。所分离的病毒不能凝集鸡红细胞，判定为DHV单一感染。

2.3 分离病毒的血清学特性 将DHV分离株与I型DHV标准阳性血清孵育，接种鸭胚。中和试验结果显示，分离株1:2稀释液被DHV阳性血清中和后，24～144h的鸭胚死亡率为100%，1:2000稀释液被DHV阳性血清中和后，24～144h的鸭胚死亡率分别为80%，这株病毒与I型DHV阳性血清的交叉保护率为20%。

表2 I型DHV阳性血清对DHV分离株的交叉保护率

2.4 分离株对雏鸭的致病性 将分离株按照 0.2ml/只接种雏鸭，其对雏鸭的致死率为 30%～60%。雏鸭在接种后2～3d达到死亡高峰，表现为突然发病、不食，死亡快，发病鸭共济失调，全身抽搐，临死前雏鸭横卧，双腿呈划水状，出现背脖后仰现象，死亡时角弓反张，剖检病变主要表现为肝脏出血等病毒性肝炎特征性病变。

3 小结

鸭传染性肝炎是困扰养鸭业发展的主要传染病之一，死亡率高达30%～90%。但是，近几年来发现该病出现变异株或新型毒株，使病毒性肝炎连续不断发生。这种发病规律与该研究对其病原学的研究结果一致。该分离的DHV毒株对鸭胚具有高致病性，均符合DHV的目前流行特点，分离株对鸭胚的致死率为30%～60%，与I型病毒性肝炎阳性血清几乎不能提供交叉保护。该研究从发病鸭群中分离到的分离株，明确了病原，为开展该病的防制工作提供了科学依据。

S858.32

B

1007-1733(2014)06-0054-02

2014–03–28）