骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白的表达调控研究

胡小东，马信文

（攀枝花市第二人民医院骨科，四川 攀枝花 617028）

·论著·

骨关节炎软骨细胞中骨桥蛋白的表达调控研究

胡小东，马信文

（攀枝花市第二人民医院骨科，四川 攀枝花 617028）

目的检测骨关节炎(OA)患者骨桥蛋白(OPN)的表达，探讨Wnt/β-catenin信号通路对OPN的表达调控作用。方法分离OA患者(骨关节炎组12例)的软骨细胞，并取非OA患者软骨细胞作为正常对照(8例)，荧光定量PCR检测OPN基因的表达；基因转染双链siRNA干扰β-catenin基因的表达；Western blot实验检测β-catenin和OPN蛋白的表达改变。结果骨关节炎组和正常对照组软骨细胞OPN的mRNA表达量分别为(0.642±0.155)和(0.226±0.077)，两组比较差异有统计学意义(t=6.74，P＜0.01)。特异性靶向双链siRNA可以下调β-catenin的表达，Western blot检测显示下调β-catenin蛋白的表达后软骨细胞OPN蛋白的表达也出现了相应的下调。结论骨关节炎患者中存在骨桥蛋白的表达上调，骨桥蛋白的上调受到Wnt/β-catenin通路的调控。

骨关节炎；骨桥蛋白；Wnt/β-catenin信号通路

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)又称退化性关节炎、退行性关节病或骨关节病，是一组关节软骨或软骨下降解的机械异常性疾病，骨关节炎是一个常见的老年性骨科慢性疾病。80%的65岁以上的老人都会有骨关节的影像学改变，大约60%的老人会有临床症状，流行病学统计显示近年来骨关节炎的发病有逐年增加的趋势[1-2]。骨关节炎的发病机制十分复杂，目前仍不清楚，最近的研究显示骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)在关节软骨的退行性变中发挥着关键的调节作用，可以诱发OA的发生[3-4]。本研究观察了骨关节炎患者骨桥蛋白表达的异常，并探讨了Wnt/β-catenin信号通路对OPN的表达调控作用。

1 资料与方法

1.1 病例选择选取2012-2013年人工关节置换术的OA患者12例，其中男性4例，女性8例，年龄56～71岁，平均(61.5±9.4)岁，骨关节炎诊断标准参照中华医学会骨科学分会修定的《骨关节炎诊治指南》[5]，术中在软骨退变区削取软骨标本。另取本院因外伤手术时的游离软骨8例作为正常对照，排除骨性关节炎患者。其中男性3例，女性5例，年龄51～72岁，平均(63.4±9.2)岁，两组样本在性别、年龄等一般临床资料方面比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 试剂DMEM培养基购自杭州四季青生物工程材料有限公司，Trizol、RT-PCR试剂盒、SYBR Green荧光定量检测试剂盒购自美国基因公司，β-连环蛋白(β-catenin)siRNA干扰试剂盒购自上海吉玛生物科技有限公司，Ⅱ型胶原酶β-catenin、OPN、内参和二抗为美国R.D公司产品。

1.3 单细胞的制备和培养按照Matsui等[6]的方法分离软骨细胞，简述如下：分离的软骨剪碎，加入0.2%的Ⅱ型胶原酶37℃，水浴消化6～8 h，吹打细胞制备单细胞悬液，软骨细胞放置于细胞培养箱培养于DMEM培养液中。采用RT-PCR方法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达水平来鉴定软骨细胞。

1.4 荧光定量PCR严格按照Trizol和RT-PCR试剂盒说明书操作提取分离的软骨细胞RNA，并同时反转录合成cDNA第一链，按照荧光定量PCR检测试剂盒说明书操作，PCR反应管加入上下游引物，OPN：上游：5'-CCTTCCAACGATCTCTTACTACTTGG-3'下游：5'-ACTGGAAGCAAGAGGGGATG-3'；β-actin：上游：5'-AGTGTGTGAAGAAGGGTCG-3'，下游：5'-GGCAGTGATGGCATGGAACATA-3'，仪器为美国ABI公司Prism7500荧光定量PCR仪，程序设定为：95℃1 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s，35个循环。△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值，目的基因的表达量采用2-△Ct评估。

1.5 基因沉默分离的OA患者软骨细胞接种于6孔板，细胞达到60%～80%融合时，实验分为对照(A)组、特异性RNA干扰(B)组、阴性RNA干扰对照(C)组，按照β-catenin RNA干扰试剂盒说明书使用Lipofectin 2000转染小分子双链RNA干扰序列。β-catenin干扰序列为5'-AGCGCUUGGAGCUCGAGAAdTdT-3'(正义链)，48 h后提取细胞总蛋白，Western blot检测β-catenin基因沉默的效果。

1.6 Western blot1×SDS上样缓冲液裂解上述处理的软骨细胞，取50 μg蛋白SDS-PAGE胶电泳，蛋白电转移至PVDF膜，按照抗体试剂盒说明书操作加入稀释的特异性一抗孵育PVDF膜，4°C过夜，二抗室温1 h，使用化学发光反应，暗室X-ray曝光，1 min后显示目的条带。

1.7 统计学方法应用SPSS16.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨关节炎患者软骨细胞骨桥蛋白表达的改变骨关节炎组和正常对照组软骨细胞骨桥蛋白的mRNA表达量(2-△Ct值)分别为(0.642±0.155)和0.226± 0.077，统计学分析显示两组之间差异具有统计学意义(t=6.74，P＜0.01)，见图1。

图1 骨桥蛋白mRNA表达的荧光定量PCR检测

2.2 β-catenin siRNA对骨关节炎患者软骨细胞骨桥蛋白表达的抑制作用从图2可见特异性靶向双链siRNA下调了β-catenin的表达，而阴性对照siRNA对β-catenin的表达水平没有显著的影响，说明本研究所用的双链β-catenin siRNA能够有效抑制β-catenin的表达。靶向β-catenin双链siRNA干扰骨关节炎患者软骨细胞48 h后，在下调β-catenin的同时也降低了软骨细胞OPN蛋白的表达，说明β-catenin调控了OPN蛋白的表达，见图2。

图2 RNA干扰β-catenin后Western blot检测β-catenin和OPN蛋白

3 讨论

骨关节炎(OA)的发病率约占总人口的10%左右，一般随着年龄的增长OA的患病率会逐渐增加。据世界卫生组织统计，50岁以上人群OA的发病率可达到50%，55岁以上发病率甚至可达到80%，软骨细胞的代谢异常和退行性变是OA的主要病理改变[7]，但是其具体的发病机制目前仍不清楚，因此探讨软骨细胞退行性变的机制将会为OA的防治提供新的靶点和理论依据。

骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种多功能的磷酸化糖蛋白，通过与单核细胞和内皮细胞上的受体结合，调节不同的生物学过程，例如免疫反应、血管生成、软骨内化骨、细胞再生、骨质疏松病变的起始等。OPN可以通过增强IL-12和抑制IL-10活性调节Th1 T淋巴细胞的反应来参与炎症反应，有研究显示OPN是OA中最早出现也是最主要的病理改变，OPN可以通过上调MMP-13和减少组织中的蛋白多糖致软骨的退行性变，还可以诱导软骨细胞的凋亡破坏关节软骨[8-9]，本研究的结果也显示了OA患者软骨细胞中OPN的表达显著高于正常对照。

β-连环蛋白(β-catenin)蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白，Wnt/β-catenin通路激活时可使β-catenin蛋白游离出来计入细胞核发挥转录因子的作用调控下游靶基因的表达。已有研究显示Wnt/β-catenin通路在保持关节完整性方面起着重要作用，例如在β-catenin转基因的小鼠中可发现关节骨赘的形成，同时软骨下有新的编织骨和关节软骨全层缺失[10-11]。本研究使用靶向β-catenin的siRNA沉默β-catenin基因的表达后发现OPN蛋白也出现相应的降低，提示了β-catenin对OPN具有一定的调控作用，可能的机制是激活的β-catenin入核结合到OPN启动子的上游调控元件增强了OPN的表达。

总之，本研究显示骨关节炎患者中出现了骨桥蛋白的表达上调，骨桥蛋白的上调受到Wnt/β-catenin通路的调控。

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Regulation mechanism of osteopontin expression in osteoarthritis.

HU Xiao-dong,MA Xin-wen.Department of Orthopedics,the Second People's Hospital of Panzhihua City,Panzhihua 617028,Sichuan,CHINA.

ObjectiveTo detect the expression of osteopontin(OPN)in osteoarthritis(OA)patients,and explore the regulation mechanism of OPN by Wnt/β-catenin signaling pathway.MethodsThe chondrocytes were separated from OA patients(12 cases as OA group)and non-OA patients(8 cases as control group).The mRNA expression of OPN was determined by real-time PCR analysis.The small interfering RNA was used to specifically knockdown β-catenin in chondrocytes.And then the expression of β-catenin and OPN protein were detected by Western blot.ResultsThe 2-△Ctvalues of OPN mRNA were(0.226±0.077)and(0.642±0.155)in control and OA group,respectively.There was significant difference between the two groups(t=6.74，P＜0.01).The expression of β-catenin was significantly and specifically down-regulated by siRNA duplexes and a corresponding down-regulation was also detected in OPN protein expression by Western blot.ConclusionThere is an up-regulated expression of OPN in osteoarthritis patients,which is mediated by Wnt/β-catenin signaling pathway.

Osteoarthritis(OA);Osteopontin(OPN);Wnt/β-catenin pathway

R684.3

A

1003—6350（2014）13—1877—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0730

2013-12-25)

胡小东。E-mail：hdxong@163.com