毒素蛋白CcdB在载体构建中的研究及应用

范凯荣，覃石磊，黄进波，晁耐霞

广西医科大学 基础医学院，广西 南宁 530021

Ccd（control of cell division or death system）系统位于大肠杆菌F质粒上，与细菌分裂后生存和SOS修复诱导有关，也是最早被发现、目前研究最为深入的一种毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin sys⁃tem，TA系统）[1]。ccd系统编码2个蛋白，分别是毒素蛋白CcdB和抗毒素蛋白CcdA。毒素蛋白CcdB通过使细菌促旋酶失活而导致细菌死亡，CcdA可通过直接结合CcdB蛋白形成复合体解除其毒性。由于细胞内CcdA蛋白相对于CcdB蛋白比较易降解，从而导致丢失F质粒的子代细菌的死亡[2]。这一原理被广泛应用于各种高效低背景质粒的载体构建中，广泛应用于基因克隆和基因功能的研究。

1 ccd系统及其致死效应作用原理

1.1 ccd系统的组成及结构

ccd 系统定位于大肠杆菌 F 质粒的 42.9～43.6 kb，毒素蛋白基因ccdB与抗毒素蛋白基因ccdA位于同一个操纵子内，前后相邻排列[3]。毒素蛋白CcdB（相对分子质量为11.7×103）比较稳定，有5个反向平行β折叠紧接着C端的α螺旋，其中的一个β折叠上有3个小的翼型折叠，上面含有LysC蛋白水解切割位点和CcdA识别位点[4]。抗毒素蛋白CcdA（相对分子质量为8.7×103）比较不稳定，在细胞内易被Lon蛋白酶水解；其N端结构域是DNA结合结构域，能够特异性识别位于ccd操纵子上6 bp的DNA启动子区域（回文结构），通过带正电荷的折叠插入DNA的大沟起到调节作用，其C端与CcdB蛋白结合[5]。

1.2 ccd系统致死效应作用原理

研究认为，CcdB蛋白主要通过捕捉断裂的DNA-促旋酶复合体并使细胞内拓扑异构酶失活，从而干扰DNA的合成，进而杀伤宿主细胞。促旋酶是原核生物细胞中高度保守的酶，属于拓扑异构酶Ⅱ，导入负超螺旋进入同一闭合双链DNA中。由于在高等生物中缺乏促旋酶类似物，因此促旋酶是抗生素类药物研究的重要靶标。大肠杆菌的促旋酶为四聚体，由2个GyrA亚基和2个GyrB亚基组成。促旋酶能够识别DNA超螺旋[6]，促旋酶GyrA二聚体的N端相对分子质量为60×103的结构域可以切断DNA双链，形成DNA门（DNA gate）。GyrA亚基C端与临近DNA门的一段DNA（T segment，又称DNA T片段）缠绕变构后与GyrB亚基N端结构域结合。GyrB的N端结构形状类似于钳子，与1分子ATP结合变构形成闭合状态，易于捕获DNA T片段。GyrB水解ATP后发生旋转，牵引DNA T片段从DNA门处移出，DNA门重新连接，DNA分子导入2个负超螺旋，最后GyrB再结合1分子ATP并水解，促旋酶2个亚基解离分开。CcdB蛋白能够捕捉断裂的DNA-促旋酶复合体并与之结合形成稳定的复合体，阻止促旋酶发挥活性，这一复合体导致DNA复制的终止。同时也有研究证实，这一复合体也能阻滞RNA聚合酶的前进，最终导致转录终止。分析CcdB-GyrA的晶体结构得知，当DNA呈线性结构时，促旋酶上的信息才会诱导CcdB发挥致死作用[7-9]。

CcdB的致死作用可被抗毒素蛋白CcdA抑制。CcdA分子的C端可与CcdB上2个部分重叠的位点实行连续的非共价结合，并引发CcdB构象改变，使得CcdB-促旋酶复合体因为局部构象的改变而出现分离[10]。CcdA的C端41个氨基酸残基是结合CcdB的必需残基。不同的自然坏境下CcdA和CcdB的结合模式会发生改变，其结合模式依赖于两者间的浓度比，即CcdA与CcdB之间的比率大于等于1时，二聚物（CcdA）2和（CcdB）2相互交替组成链状四聚体（CcdA）2（CcdB）2时，CcdA对CcdB有抑制作用；相反，当CcdA与CcdB之间的比率小于1时，就会形成六聚体（CcdA）2（CcdB）4，此时CcdA对CcdB无抑制作用[11]。此外，（CcdA）2（CcdB）2复合体还能抑制ccd操纵子的转录，这一功能主要通过复合体中CcdA蛋白与ccd操纵子启动子区域的结合来实现，CcdB的结合促进CcdA与DNA的亲和性增高，结合区域位于ccdB开放读框起始位点上游113 bp处。因此，不同的CcdA和CcdB间的浓度比，也决定ccd操纵子的开与关，从而使两者的含量处于动态平衡中，以精确地调控细菌的生长[12]。

2 CcdB在质粒载体构建中的应用

2.1 ccdB基因在载体构建中的应用原理

基因克隆和表达是基因组学和蛋白组学研究的基础，目前基因克隆过程中重组体筛选系统通常采用遗传检测方法，即抗药性标记插入失活、β-半乳糖苷酶显色反应和插入序列表性特征等，能够鉴别阳性克隆和阴性克隆，但也伴有多种因素造成的不可避免的假阳性克隆问题，以及繁琐的验证工作量。将ccdB同源基因同框融合进入重组质粒，重组质粒编码的CcdB蛋白对宿主细胞具有致死效应；而在该同源基因内插入外源基因片段，则导致ccdB读框移码突变，编码的CcdB蛋白丧失了对宿主的毒性，从而使重组表达质粒在宿主细胞内生存繁殖生存，最终达到阳性筛选的作用，同时也能有效降低背景阴性克隆和假阳性克隆，极大地减少了验证工作量。自Bernard和Couturier等发现促旋酶突变的大肠杆菌促旋梅突变体（GyrA Arg462→Cys）对CcdB蛋白的毒性耐受[13]，使得CcdB蛋白被广泛应用于高效低背景的质粒载体构建。此外，CcdB毒性往往与抗药性标记插入失活或β-半乳糖苷酶显色反应一起应用于基因克隆重组子的筛选，大大提高了筛选阳性克隆的效率。

2.2 ccdB基因在载体构建中的应用

目前ccdB基因同源片段已用于多种高效低背景质粒载体的构建，如TA克隆载体、平末端克隆载体、表达载体等，这些载体广泛应用于细菌、真菌、植物和动物基因的功能研究，详见表1。

最先将ccdB基因引入载体构建的是比利时的Philippe等，他们将ccdB基因与pUC18/19质粒的lac启动子后的多克隆位点区域同框融合，构建衍生的质粒pKIL18/19，将该衍生质粒转化进入促旋酶野生型的大肠杆菌后能抑制细菌的生长；而当ccdB基因被外源片段插入后，则没有抑制细菌生长的功能，在丰富培养基上才可以形成可见的克隆[14]。

表1 利用ccdB基因构建的载体举例

TA克隆法因操作简单、快速高效，而被广泛应用于基因工程，多数实验室对目的基因的克隆常选用TA克隆法，利用ccdB构建的载体克隆率较高。陈其军等设计的引物在ccdB片段两端分别引入一个AhdⅠ酶切位点，并对模板进行PCR扩增，利用定点突变方法沉默pBlueScriptSK（-）载体中Amp抗性基因的AhdⅠ酶切位点，获得骨架pSKAΔhd，将PCR产物与pSKAΔhd分别用SalⅠ、XbaⅠ双酶切，经连接反应，获得前T载体pSK01（pSK02和pSK03构建方法相同），经AhdⅠ酶切即得T载体。他们通过克隆 NCED3（1.8 kb）和 DREB1A（0.68 kb）进行验证，克隆率均为100%（除pSK03与DREB1A克隆率为96%外）。另外，ccdB在该载体构建中除致死效应外，还起到间隔作用，解决了非重组转化子的本底过高的问题。但TA克隆法仍存在加尾效率和连接效率低等问题[15-16]。

近年来，Hu等用ccdB片段构建出平末端载体，既避免了TA克隆法中加尾效率等问题，又可降低假阳性克隆率。该课题组首先对3对寡聚核苷酸链进行PCR扩增，在5'端和3'端分别引入Eco31Ⅰ位点，PCR扩增产物经Eco31Ⅰ酶切、连接成环状ccdB基因，再与骨架pUC18分别用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，连接获得前载体pUC-ccdB，经EcoRⅤ或SmaⅠ酶切即得平末端载体。实验者用不同大小的PCR产物进行验证，93 bp插入片段可使ccdB基因失活；3000 bp片段的转化效率为每毫克DNA转化数3×105～5×105，且无假阳性克隆转化子[17]。

ccdB基因片段还可插入载体构建表达载体。pGR-PSLIC、pJL-PSLIC、pMBP1-PSLIC是基于LIC的植物表达载体，在其构建过程中将SnaBⅠ位点分别引入骨架载体和ccdB片段，ccdB插入骨架载体2个LIC连接位点之间，所得前载体经SnaBⅠ酶切即可获得表达载体。该系列载体可为植物基因组学研究提供高效、高产量的表达分析工具[18]。

2.3 利用ccdB构建载体技术的商业化

Invitrogen公司已推出多种克隆技术，并利用ccdB进行了改进。Gateway技术即利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆，典型的效率高于95%。Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdb Survival Competent Cells，就是通过在中间载体2个重组位点间添加ccdB筛选标记来实现的。Zero Background技术采用ccdB基因，能够进行高效克隆，产生近100%的重组体。Topo平端克隆技术主要改良载体设计，把ccdB基因插入多克隆位点，改善了传统TA克隆高背景的缺点，并节省筛选时间。Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒结合了Zero Background技术和pCR-Blunt II-TOPO载体中的TOPO克隆，能简单、高效地对使用高保真PCR酶生成的平端PCR产物进行DNA克隆。

3 结语

目前，以ccdB基因作为阳性选择的标记物应用到高效零背景载体的构建已成为基因工程研究的重要方法。但ccdA、ccdB基因家族仅在5种革兰阴性菌中有发现，且表达功能不甚相同，因此，研究ccdA、ccdB基因家族的功能和分布特点，以及诱导对大部分细菌有抑制作用的CcdB蛋白表达，将为CcdB的广泛应用奠定基础。此外，如何将ccdB与其他筛选标记联合应用从而达到更高效的筛选效果，是未来利用ccdB构建载体的另一个发展方向。

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