人Toll样受体9基因启动子区的生物信息学分析

唐亮，王燕，陈碧峰

1.长沙医学院 基础医学系，湖南 长沙 410219；2.香港中文大学 生物医学院，香港

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）是免疫过程中重要的病原体识别受体，在天然免疫和获得性免疫过程中起重要作用[1]。TLR9属于TLR家族，定位于内体膜上，在序列结构上具有高度的保守性[2]。TLR9广泛表达于机体各处组织，且具有组织特异性。在细胞水平上，TLR9主要表达于抗原提呈细胞，T细胞、单核细胞等中的TLR9表达量很少。不同动物、不同细胞群的表达水平差异较大。研究表明，免疫细胞通过TLR9识别含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）[3]。TLR9表达失衡可能导致动物感染性疾病[4]、自身免疫性疾病[5]及肿瘤[6]等。

表观遗传学研究提示CpG岛甲基化在基因表达调控中的重要作用，尤其是启动子区序列甲基化状态对基因的表达影响深远。进一步探讨TLR9基因表达调控，有利于深入了解其在疾病发生中的生物学作用。我们利用生物信息学技术预测了TLR9基因启动子区，获得了基因启动子区的甲基化区域及转录因子结合部位，为进一步研究TLR9基因在疾病患者中的基因调控研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

在GenBank数据库中检索人（HOMO）和小鼠（MUS）TLR9基因，ID分别为54106和81897，获得Genbank格式文件。

在线核算数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）；序 列 对 比 BLASTN（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）；启动子在线分析软件［Promoter 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）；Network Promot⁃er Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promot⁃er.html）；Promoter SCAN（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）］；转录因子预测软件（P-Match 1.0，http://www.gene-regulation.com/pub/programs.ht⁃ml#match）；两序列间保守区域转录因子结合部位预测 软 件（Consite，http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite/）；CpG 岛预测软件（http://cpgis⁃lands.usc.edu/）。

1.2 方法

获得人和小鼠TLR9基因同源序列，确定TLR9基因启动子区，利用上述软件预测TLR9基因启动子。利用P-Match 1.0程序，核心序列相似性设定为0.80，矩阵相似性设定为 0.85，输入 TLR9 基因上游3000 bp序列，搜索转录因子结合部位，获得启动子区转录因子结合位点。利用Consite程序搜索人与小鼠TLR9基因保守区，排除假阳性结合部位。将TLR9启动子区域序列导入CpG岛在线软件进行甲基化预测。

2 结果

2.1 人和小鼠TLR9基因启动子定位

人TLR9基因定位于染色体3p21.3，有2个外显子、1个内含子。转录mRNA的ID为NT_022517，跨越5084 bp。小鼠TLR9基因定位于染色体9F1;9，转录mRNA的ID为NM_031178.2，跨越4279 bp。

2.2 TLR9基因启动子预测结果

通过检索GenBank数据库，对人TLR9基因第一外显子上游3000 bp序列采用3种软件预测分析，得出潜在的启动子结构（表1）。用3种不同的在线软件预测的TLR9基因启动子区域有一定的差异。用Promoter Scan程序未预测到相应的启动子区域，提示可能该启动子缺失保守序列TATA盒。

2.3 TLR9基因启动子区转录因子结合位点分析

采用P-Match 1.0程序，核心序列相似性设定为0.80，矩阵相似性设定为 0.85，输入 TLR9 基因上游3000 bp序列，搜索库中脊椎动物转录因子结合部位数据库，获得启动子区转录因子结合位点共1434个。利用足迹法，采用Consite程序分析人与小鼠TLR9基因保守区域，对比确定保守区域中共有的转录因子有23个（表2）。

2.4 启动子CpG岛预测结果

用CpG岛预测软件分析人TLR9基因启动子，发现该序列存在长度为572 bp（798～1359 bp）的CpG岛，（G+C）含量为 66.4%，CpG 观测值/预测值为0.679。见图1。

3 讨论

启动子是RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。基因启动子DNA的甲基化状态及转录因子结合顺序决定了基因表达的时间、空间及数量等特性，也是基因表达调控的重要组成部分。现阶段采用实验方法检测基因启动子CpG岛和转录因子结合位点的难度较大。基于生物信息学技术，采用预测软件，以理论预测的方法可以有效、快速地获得基因的结构和状态。

然而，基于各种算法的在线预测软件对启动子区、CpG岛及转录因子结合位点的预测并不完全可靠。启动子的预测算法有多种。Promoter 2.0是基于启动子区转录信号，如TATA盒、CAAT盒、GC盒等位置和距离的一类算法的预测软件，而Promoter Scan是基于转录因子结合部位分布密度与TATA盒的权重矩阵而开发的预测软件。不同的算法有不同的预测结果，且存在假阳性，须综合考虑。

在转录因子结合位点的预测中，程序只能针对已知位点进行预测，对未知的、新的转录因子结合位点则无法分析。从人TLR9基因启动子区预测到与小鼠同源的23个转录因子结合位点，提示TLR9基因启动子在进化上高度保守，为今后进行异种转基因及相关实验提供了参考。

表1 TLR9基因启动子预测结果

表2 人TLR9基因启动子区转录因子结合位点预测结果

图1 人TLR9基因启动子CpG岛分析结果

在哺乳动物中，DNA甲基化位点主要发生在CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上[7]。CpG以散在和集聚（CpG岛）两种形式存在。DNA的甲基化不仅影响基因本身的表达，而且这种影响能够遗传下去。而TLR9基因启动子区存在572 bp的CpG岛，预示着此段基因序列可能与感染性疾病、自身免疫病及肿瘤等发生有关，但此结论需要进一步的实验验证。

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