山羊皮肤组织SCF基因的克隆与序列分析

张军杰等

摘要：对山羊SCF基因的结构与序列进行了分析，参考山羊和绵羊SCF基因序列设计引物，利用PCR克隆获得了山羊SCF基因的两个剪接体序列，同时对其进行了生物信息学分析。结果表明，山羊SCF基因分泌型和跨膜型编码区长度分别为825 bp和741 bp，长度差异主要是由外显子6缺失/插入引起的，与绵羊和牛的同源性分别为98%和97%。13个物种的SCF基因的系统发育聚类与动物分类学基本一致。

关键词：山羊；SCF基因；分泌型；跨膜型

中图分类号：S827；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）02-0450-03

Cloning and Sequence Analysis of SCF Gene in Goat Skin Tissue

ZHANG Jun-jie1，XI Jian-zhong1，ZHOU Rong-yan1，2，LI Xiang-long1，2，LI Lan-hui1，CHEN Hui1，

ZHANG Zhen-hong1，ZHAO Zhu-jun1，2

（1.College of Animal Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding 071001， Hebei， China；2.Embryo Engineering and Technological Centre of Cattle and Sheep of Hebei Province， Baoding 071001， Hebei， China）

Abstract： To investigate the structure and sequence of SCF gene in goat， primers were designed based on the sequence of goat and sheep. Two transcript splices were obtained with PCR and cloning and bioinformatics analysis of the sequence was made. The results showed that the length of coding sequence of soluble and transmembrane SCF gene in goat is 825 bp and 741 bp， respectively. The length difference was due to the deletion/insertion of 6th exon. The identity of SCF gene between goat and sheep or cattle was 98% and 97%， respectively. The phylogenetic clusters based on SCF gene sequence of thirteen species were the same as the zootaxy.

Key words： goat； SCF gene； soluble type； transmembrane type

哺乳动物毛色是由体内黑色素决定的，黑色素包括真黑素（Eumelanin）和褐黑素（Phenomelanin）。真黑素使毛发表现为褐色和黑色，褐黑素使毛发表现为黄色和红色，两种色素分布与比例的不同表现为哺乳动物不同的毛色类型。黑色素存在于黑素细胞的黑素体中，这些黑素体在被毛的生长过程中通过胞吐作用转移至被毛，黑素细胞的增殖与分化是黑色素产生的关键。

皮肤中的干细胞因子（Stem cell factor，SCF），也称为kit配体或青灰因子，主要来源于角质形成细胞，由于转录过程中存在着差异，干细胞因子在体内以分泌型（s-SCF）和跨膜型（tm-SCF）两种形式存在，通过其受体c-kit介导细胞的增殖、分化等生物学功能。SCF/c-kit信号通路在调节黑素细胞的存活、分化、移行和增殖等过程中起重要作用[1]。在哺乳动物中毛色是绒、毛、羔皮及裘皮用山羊的重要经济性状，也是识别个体、血液系统和品种归属的遗传标志之一。因此，本研究克隆了山羊皮肤组织中的SCF基因序列，同时进行了结构分析，并基于测定序列构建了进化树，为进一步研究SCF基因在毛色形成中的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

EasyPure RNA Kit、pEASY-T3 Cloning Kit和感受态细胞Trans1-T1购自北京全式金生物技术有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase Hˉ）、Recombinant Ribonuclease Inhibitor和Oligo d（T）18 Primers购自宝生物工程（大连）有限公司；Taq DNA聚合酶和dNTPs购自天根生化科技（北京）有限公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒和SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 山羊皮肤组织总RNA的提取

取冻存的山羊皮肤组织，按照RNA提取试剂盒说明书进行总RNA的提取，并用核酸蛋白测定仪进行浓度与纯度的测定，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，利用M-MLV反转录酶进行cDNA第一链合成。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank中山羊SCF基因序列，利用Primer 5.0 软件设计了3对特异性引物，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。扩增外显子1-6的引物正向序列：5′-GCGCTGCCTTTCCTTATGA-3′，反向序列：5′-ATTACTGCTACTGCTGTCATTCCT-3′；扩增外显子5-7的引物正向序列：5′-GGACTTGGAGATAGTGGCTTC-3′，反向序列： 5′-CCATTGTAGGCTGGAATCT-3′；扩增外显子4-10的引物正向序列5′-GATAAGCGAGATGGTGGAA-3′，反向序列：5′-CATGGGTAGCAAGAACAGATAAA

G-3′。预期扩增片段大小分别为621、195 （外显子6缺失后为111 bp）和761 bp。

1.4 SCF基因克隆及遗传进化分析

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

所提取的皮肤组织总RNA以1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰。用核酸测定仪进行测定RNA纯度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.8～2.0之间。

2.2 山羊SCF基因序列扩增结果

以cDNA为模版，利用3对引物PCR扩增结果见图1。将PCR产物回收纯化克隆测序，电泳条带大小与预期大小一致。

2.3 山羊跨膜型与分泌型SCF基因序列分析

外显子6含有切割位点，分泌型SCF基因开放阅读框长度为825 bp，与绵羊和牛的核苷酸序列相似性分别为98%和97%，推测编码274个氨基酸。跨膜型SCF基因开放阅读框长度为741 bp，与牛的核苷酸序列相似性为97%，推测编码246个氨基酸。经过序列比对，确定了山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列长度大于跨膜型是由于外显子6的存在引起的。山羊SCF基因跨膜型与分泌型的结构如图2所示。

2.4 不同物种SCF基因的遗传进化分析

利用不同物种SCF基因编码区序列所构建的系统发育树见图3。同一物种SCF基因跨膜型与分泌型先聚为一类，然后再与其他物种聚为一类。13个物种的SCF基因进行系统发育分析结果与动物分类学基本一致。

3 小结与讨论

干细胞因子通过与黑素细胞表面的c-kit受体结合，以控制黑素细胞生长、增殖与分化，SCF-kit通道的阻断可抑制已分化黑素细胞的黑素形成[2]。黑素细胞来源于神经嵴，SCF在胚胎发生过程中对黑素细胞的迁移起了决定性作用。SCF或kit基因的突变会导致人类色素沉着受损和小鼠皮毛色素缺失[3]。SCF-kit在调节皮肤组织中黑素细胞的数量和增殖活性中起着重要作用[4，5]。研究克隆得到了山羊皮肤组织中的两个剪接体，经过序列分析确定这两个剪接体分别为跨膜型与分泌型SCF基因序列，且与其他物种具有较高的相似性，说明该基因在不同物种中具有较强的保守性。同时发现山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列长度大于跨膜型是由于外显子6的存在引起的，这与SCF基因在其他物种中的剪接类型是相同的。

参考文献：

[1] WEHRLE-HALLER B. The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis[J]. Pigment Cell Research，2003，16（3）：287-296.

[2] VANOVER J C， SPRY M L， HAMILTON L，et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice[J]. Pigment Cell & Melanoma Research，2009，22（6）：827-838.

[3] LONGLEY B J， CARTER E L. SCF-KIT pathway in human epidermal melanocyte homeostasis[J]. Journal of Investigative Dermatology，1999，113（1）：139-140.

[4] 王大光，朱文元.干细胞因子对黑素细胞调控的研究进展[J]. 国外医学皮肤性病学分册，2003，29（5）：315-317.

[5] 沈丹蓓，曾学思.干细胞因子对人黑素细胞的作用和影响[J].细胞生物学杂志，2003（5）：268-272.

G-3′。预期扩增片段大小分别为621、195 （外显子6缺失后为111 bp）和761 bp。

1.4 SCF基因克隆及遗传进化分析

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

所提取的皮肤组织总RNA以1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰。用核酸测定仪进行测定RNA纯度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.8～2.0之间。

2.2 山羊SCF基因序列扩增结果

以cDNA为模版，利用3对引物PCR扩增结果见图1。将PCR产物回收纯化克隆测序，电泳条带大小与预期大小一致。

2.3 山羊跨膜型与分泌型SCF基因序列分析

外显子6含有切割位点，分泌型SCF基因开放阅读框长度为825 bp，与绵羊和牛的核苷酸序列相似性分别为98%和97%，推测编码274个氨基酸。跨膜型SCF基因开放阅读框长度为741 bp，与牛的核苷酸序列相似性为97%，推测编码246个氨基酸。经过序列比对，确定了山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列长度大于跨膜型是由于外显子6的存在引起的。山羊SCF基因跨膜型与分泌型的结构如图2所示。

2.4 不同物种SCF基因的遗传进化分析

利用不同物种SCF基因编码区序列所构建的系统发育树见图3。同一物种SCF基因跨膜型与分泌型先聚为一类，然后再与其他物种聚为一类。13个物种的SCF基因进行系统发育分析结果与动物分类学基本一致。

3 小结与讨论

干细胞因子通过与黑素细胞表面的c-kit受体结合，以控制黑素细胞生长、增殖与分化，SCF-kit通道的阻断可抑制已分化黑素细胞的黑素形成[2]。黑素细胞来源于神经嵴，SCF在胚胎发生过程中对黑素细胞的迁移起了决定性作用。SCF或kit基因的突变会导致人类色素沉着受损和小鼠皮毛色素缺失[3]。SCF-kit在调节皮肤组织中黑素细胞的数量和增殖活性中起着重要作用[4，5]。研究克隆得到了山羊皮肤组织中的两个剪接体，经过序列分析确定这两个剪接体分别为跨膜型与分泌型SCF基因序列，且与其他物种具有较高的相似性，说明该基因在不同物种中具有较强的保守性。同时发现山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列长度大于跨膜型是由于外显子6的存在引起的，这与SCF基因在其他物种中的剪接类型是相同的。

参考文献：

[1] WEHRLE-HALLER B. The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis[J]. Pigment Cell Research，2003，16（3）：287-296.

[2] VANOVER J C， SPRY M L， HAMILTON L，et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice[J]. Pigment Cell & Melanoma Research，2009，22（6）：827-838.

[3] LONGLEY B J， CARTER E L. SCF-KIT pathway in human epidermal melanocyte homeostasis[J]. Journal of Investigative Dermatology，1999，113（1）：139-140.

[4] 王大光，朱文元.干细胞因子对黑素细胞调控的研究进展[J]. 国外医学皮肤性病学分册，2003，29（5）：315-317.

[5] 沈丹蓓，曾学思.干细胞因子对人黑素细胞的作用和影响[J].细胞生物学杂志，2003（5）：268-272.

G-3′。预期扩增片段大小分别为621、195 （外显子6缺失后为111 bp）和761 bp。

1.4 SCF基因克隆及遗传进化分析

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

所提取的皮肤组织总RNA以1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰。用核酸测定仪进行测定RNA纯度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.8～2.0之间。

2.2 山羊SCF基因序列扩增结果

以cDNA为模版，利用3对引物PCR扩增结果见图1。将PCR产物回收纯化克隆测序，电泳条带大小与预期大小一致。

2.3 山羊跨膜型与分泌型SCF基因序列分析

外显子6含有切割位点，分泌型SCF基因开放阅读框长度为825 bp，与绵羊和牛的核苷酸序列相似性分别为98%和97%，推测编码274个氨基酸。跨膜型SCF基因开放阅读框长度为741 bp，与牛的核苷酸序列相似性为97%，推测编码246个氨基酸。经过序列比对，确定了山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列长度大于跨膜型是由于外显子6的存在引起的。山羊SCF基因跨膜型与分泌型的结构如图2所示。

2.4 不同物种SCF基因的遗传进化分析

利用不同物种SCF基因编码区序列所构建的系统发育树见图3。同一物种SCF基因跨膜型与分泌型先聚为一类，然后再与其他物种聚为一类。13个物种的SCF基因进行系统发育分析结果与动物分类学基本一致。

3 小结与讨论

干细胞因子通过与黑素细胞表面的c-kit受体结合，以控制黑素细胞生长、增殖与分化，SCF-kit通道的阻断可抑制已分化黑素细胞的黑素形成[2]。黑素细胞来源于神经嵴，SCF在胚胎发生过程中对黑素细胞的迁移起了决定性作用。SCF或kit基因的突变会导致人类色素沉着受损和小鼠皮毛色素缺失[3]。SCF-kit在调节皮肤组织中黑素细胞的数量和增殖活性中起着重要作用[4，5]。研究克隆得到了山羊皮肤组织中的两个剪接体，经过序列分析确定这两个剪接体分别为跨膜型与分泌型SCF基因序列，且与其他物种具有较高的相似性，说明该基因在不同物种中具有较强的保守性。同时发现山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列长度大于跨膜型是由于外显子6的存在引起的，这与SCF基因在其他物种中的剪接类型是相同的。

参考文献：

[1] WEHRLE-HALLER B. The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis[J]. Pigment Cell Research，2003，16（3）：287-296.

[2] VANOVER J C， SPRY M L， HAMILTON L，et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice[J]. Pigment Cell & Melanoma Research，2009，22（6）：827-838.

[3] LONGLEY B J， CARTER E L. SCF-KIT pathway in human epidermal melanocyte homeostasis[J]. Journal of Investigative Dermatology，1999，113（1）：139-140.

[4] 王大光，朱文元.干细胞因子对黑素细胞调控的研究进展[J]. 国外医学皮肤性病学分册，2003，29（5）：315-317.

[5] 沈丹蓓，曾学思.干细胞因子对人黑素细胞的作用和影响[J].细胞生物学杂志，2003（5）：268-272.