小白菜无性快繁体系的建立

刘思言等

摘要：以四季小白菜（Brassica chinensis L.）和美国杂交小白菜为材料，建立了小白菜的无性快繁体系。结果表明，最佳的灭菌方法为用70%的乙醇处理30 s，

关键词：小白菜（Brassica chinensis L.）；灭菌方法；无性快繁体系

中图分类号：S634.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）02-0444-03

Establishment of the Asexual Rapid Propagation System of Pakchoi

LIU Si-yan1a，QU Bo1a，GAO Wei2，XIA Hai-feng2，GUAN Shu-yan1a，YAO Dan1a，WANG Pi-wu1b

（1a.College of Life Sciences；1b. College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；

2.Tonghua Academy of Agricultural Sciences，Meihekou 135007，Jilin，China）

Abstract： Using the pakchoi of four seasons and hybrid pakchoi from the United States as materials， an asexual rapid propagation system of pakchoi was established. The results showed that the best seed sterilization method was 70% alcohol for 30 s， then sodium hypochlorite sterilization for 15 min. MS + 0.25 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA was the best for callus induction. MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA was the best for budding induction. MS + 0.2 mg/L NAA was the best for root induction.

Key words： pakchoi（Brassica chinensis L.）； sterilization method； asexual rapid propagation system

小白菜（Brassica chinensis L.），又称青菜，属十字花科芸苔属，叶不结球卵状匙形，叶柄有狭边。小白菜原产于我国，品种很多，由于其抗寒性很强，易贮藏和运输，是我国多数地区常见蔬菜之一[1]。随着分子生物学的发展，人们开始利用转基因技术对现有的蔬菜品种进行改良[2，3]，小白菜无性快繁方面的研究已经有了许多报道[4-12]。本试验以四季小白菜和美国杂交小白菜种子诱导出的无菌实生苗为材料，以MS为基本培养基，以6-BA及NAA为调节激素，优化最佳的种子灭菌时间、诱导愈伤组织的最佳激素浓度、诱导不定芽分化和生根的最佳激素浓度，为小白菜的转基因研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验采用四季小白菜和美国杂交小白菜的无菌实生苗为材料。

1.2 方法

1.2.1 无菌实生苗的获得 选取饱满、大小一致两种小白菜种子用清水浸泡备用。种子灭菌采用3种方法：①用70%的乙醇处理30 s，再用0.1%的升汞消毒10 min，无菌水冲洗3次。②用70%的乙醇处理30 s，再用3%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次。③用70%的乙醇处理30 s，再用3%的次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗3次。将以上灭菌消毒后的种子接种到MS培养基上，12 d后统计其出苗率、污染率。

1.2.2 愈伤组织的诱导 以无菌实生苗的叶片作为外植体材料，以MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），进行愈伤组织的诱导，20 d后统计愈伤组织诱导率。

1.2.3 不定芽分化的诱导 以含芽原基的茎段为材料，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）进行不定芽分化的诱导，15 d后统计不定芽分化率。

1.2.4 不定芽生根的诱导 将生长健壮的小白菜的无根苗，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），进行小白菜的不定芽生根的诱导，20 d统计不定芽生根率。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌方法对种子萌发的影响

将用3种不同方法灭菌的小白菜种子接种到MS培养基上，置于培养室中光照培养，12 d后统计其出苗率、污染率，结果见表1。从表1可以看出，对于四季小白菜而言，用0.1%的升汞消毒10 min的方法①和用3%的次氯酸钠消毒10 min的方法②的污染率分别为12.0%和39.3%，出苗率分别为68.7%和56.7%，用次氯酸钠灭菌15 min的方法③的效果最好，污染率为10.7%，出苗率为80.7%；对于美国杂交小白菜而言，方法①和方法②的污染率分别为16.0%和32.0%，出苗率分别为63.3%和64.7%，方法③的污染率为12.0%，出苗率为90.0%。综上所述，对于两种小白菜而言，用次氯酸钠灭菌15 min的方法③都是较为理想的小白菜种子灭菌方法。

2.2 不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响

以无菌实生苗的叶片作为外植体材料，以MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），进行愈伤组织的诱导，20 d后统计愈伤组织诱导率，结果见表2。从表2可以看出，四季小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达48.0%，美国杂交小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达44.0%。

2.3 不同激素浓度对不定芽分化诱导的影响

以含芽原基的茎段为材料，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）进行不定芽分化的诱导，15 d后统计不定芽分化率，结果见表3。从表3可以看出，对于四季小白菜和美国杂交小白菜采用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA诱导出芽的效果均最好，分别达92.0%和80.0%。

2.4 不同激素浓度对不定芽生根诱导的影响

将生长健壮的小白菜的无根苗，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），进行小白菜的不定芽生根的诱导，20 d统计不定芽生根率，结果见表4。从表4可以看出，四季小白菜和美国杂交小白菜的无根苗诱导生根的最佳NAA浓度为0.2 mg/L，且根的生长状况最好。

3 小结与讨论

本试验比较了两种灭菌试剂（升汞和次氯酸钠）对种子灭菌的效果。一般而言，升汞的灭菌效果好，但其残留液最难除去，对植物组织的伤害很大[13]，所以在本试验中用升汞灭菌10 min后，虽然污染率很低，但发芽率也很低，而利用次氯酸钠灭菌15 min后，两种小白菜的发芽率分别能达到80.7%和90.0%，这和赵慧等[14]的研究结果基本一致。

本试验以四季小白菜种子和美国杂交小白菜种子为试验材料，建立了小白菜的离体再生体系，MS+ 0.25 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA为最佳的愈伤组织诱导培养基；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为最佳的不定芽分化诱导培养基；MS+0.2 mg/L NAA为最佳的生根培养基。

参考文献：

[1] 张岚翠，崔 帅，崔 博，等.小白菜无性系的建立[J].大连教育学院学报，2004，20（4）：71-73.

[2] 范正琪，崔海瑞，王忠华，等.农杆菌介导的白菜遗传转化影响因子研究进展[J].金华职业技术学院学报，2002，21（3）：10-13.

[3] 杨朝辉，雷建军，曹必好，等.芥菜转基因再生体系的建立[J].作物学报，2004，30（5）：496-501.

[4] 张初贤，佘建明，蔡小宁，等. 2，4-D 对小白菜和大白菜子叶诱导不定芽的影响[J].江苏农业研究，1999，20（4）：75-76.

[5] 陈敏敏，侯喜林.不结球白菜离体培养再生体系的优化[J].南京农业大学学报，2008，31（1）：27-30.

[6] 吕艳艳，王桂萍，沈振国，等.不结球白菜亮白叶再生体系的优化[J].中国农学通报，2010，26（23）：93-96.

[7] 侯喜林，曹寿椿.不结球白菜子叶离体培养再生植株[J].南京农业大学学报，1994，17（3）：60-64.

[8] 秦新民，高成伟.小白菜子叶离体培养再生系统的建立[J].广西师范大学学报，1997，15（4）：90-91.

[9] 邓智年，魏源文，吕维莉，等.小白菜高效子叶离体植株再生体系的建立[J].广西农业科学，2006，37（4）：350-354.

[10] 张 鹏，凌定厚.提高菜心离体植株再生频率的研究[J].植物学报，1995，37（11）：902-908.

[11] 蔡小宁，佘建民.不结球下胚轴和子叶离体培养再生植株[J].江苏农业学报，1995，11（4）：51-54.

[12] 张智奇，周 音.小白菜子叶诱导不定芽再生植株[J].上海农业学报，1998，14（2）：25-28.

[13] 柳 俊，谢从华.植物细胞工程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[14] 赵 慧，侯雷平，王 慧，等.影响小白菜子叶再生的因素[J].分子植物育种，2009，7（5）：972-977.

2.2 不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响

以无菌实生苗的叶片作为外植体材料，以MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），进行愈伤组织的诱导，20 d后统计愈伤组织诱导率，结果见表2。从表2可以看出，四季小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达48.0%，美国杂交小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达44.0%。

2.3 不同激素浓度对不定芽分化诱导的影响

以含芽原基的茎段为材料，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）进行不定芽分化的诱导，15 d后统计不定芽分化率，结果见表3。从表3可以看出，对于四季小白菜和美国杂交小白菜采用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA诱导出芽的效果均最好，分别达92.0%和80.0%。

2.4 不同激素浓度对不定芽生根诱导的影响

将生长健壮的小白菜的无根苗，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），进行小白菜的不定芽生根的诱导，20 d统计不定芽生根率，结果见表4。从表4可以看出，四季小白菜和美国杂交小白菜的无根苗诱导生根的最佳NAA浓度为0.2 mg/L，且根的生长状况最好。

3 小结与讨论

本试验比较了两种灭菌试剂（升汞和次氯酸钠）对种子灭菌的效果。一般而言，升汞的灭菌效果好，但其残留液最难除去，对植物组织的伤害很大[13]，所以在本试验中用升汞灭菌10 min后，虽然污染率很低，但发芽率也很低，而利用次氯酸钠灭菌15 min后，两种小白菜的发芽率分别能达到80.7%和90.0%，这和赵慧等[14]的研究结果基本一致。

本试验以四季小白菜种子和美国杂交小白菜种子为试验材料，建立了小白菜的离体再生体系，MS+ 0.25 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA为最佳的愈伤组织诱导培养基；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为最佳的不定芽分化诱导培养基；MS+0.2 mg/L NAA为最佳的生根培养基。

参考文献：

[1] 张岚翠，崔 帅，崔 博，等.小白菜无性系的建立[J].大连教育学院学报，2004，20（4）：71-73.

[2] 范正琪，崔海瑞，王忠华，等.农杆菌介导的白菜遗传转化影响因子研究进展[J].金华职业技术学院学报，2002，21（3）：10-13.

[3] 杨朝辉，雷建军，曹必好，等.芥菜转基因再生体系的建立[J].作物学报，2004，30（5）：496-501.

[4] 张初贤，佘建明，蔡小宁，等. 2，4-D 对小白菜和大白菜子叶诱导不定芽的影响[J].江苏农业研究，1999，20（4）：75-76.

[5] 陈敏敏，侯喜林.不结球白菜离体培养再生体系的优化[J].南京农业大学学报，2008，31（1）：27-30.

[6] 吕艳艳，王桂萍，沈振国，等.不结球白菜亮白叶再生体系的优化[J].中国农学通报，2010，26（23）：93-96.

[7] 侯喜林，曹寿椿.不结球白菜子叶离体培养再生植株[J].南京农业大学学报，1994，17（3）：60-64.

[8] 秦新民，高成伟.小白菜子叶离体培养再生系统的建立[J].广西师范大学学报，1997，15（4）：90-91.

[9] 邓智年，魏源文，吕维莉，等.小白菜高效子叶离体植株再生体系的建立[J].广西农业科学，2006，37（4）：350-354.

[10] 张 鹏，凌定厚.提高菜心离体植株再生频率的研究[J].植物学报，1995，37（11）：902-908.

[11] 蔡小宁，佘建民.不结球下胚轴和子叶离体培养再生植株[J].江苏农业学报，1995，11（4）：51-54.

[12] 张智奇，周 音.小白菜子叶诱导不定芽再生植株[J].上海农业学报，1998，14（2）：25-28.

[13] 柳 俊，谢从华.植物细胞工程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[14] 赵 慧，侯雷平，王 慧，等.影响小白菜子叶再生的因素[J].分子植物育种，2009，7（5）：972-977.

2.2 不同激素浓度对愈伤组织诱导的影响

以无菌实生苗的叶片作为外植体材料，以MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的NAA（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/L）和6-BA（0.25 mg/L），进行愈伤组织的诱导，20 d后统计愈伤组织诱导率，结果见表2。从表2可以看出，四季小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达48.0%，美国杂交小白菜采用MS+0.5 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA的愈伤组织诱导率高达44.0%。

2.3 不同激素浓度对不定芽分化诱导的影响

以含芽原基的茎段为材料，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.3、0.5、0.8 mg/L）和6-BA（3.0 mg/L）进行不定芽分化的诱导，15 d后统计不定芽分化率，结果见表3。从表3可以看出，对于四季小白菜和美国杂交小白菜采用MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA诱导出芽的效果均最好，分别达92.0%和80.0%。

2.4 不同激素浓度对不定芽生根诱导的影响

将生长健壮的小白菜的无根苗，以MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），进行小白菜的不定芽生根的诱导，20 d统计不定芽生根率，结果见表4。从表4可以看出，四季小白菜和美国杂交小白菜的无根苗诱导生根的最佳NAA浓度为0.2 mg/L，且根的生长状况最好。

3 小结与讨论

本试验比较了两种灭菌试剂（升汞和次氯酸钠）对种子灭菌的效果。一般而言，升汞的灭菌效果好，但其残留液最难除去，对植物组织的伤害很大[13]，所以在本试验中用升汞灭菌10 min后，虽然污染率很低，但发芽率也很低，而利用次氯酸钠灭菌15 min后，两种小白菜的发芽率分别能达到80.7%和90.0%，这和赵慧等[14]的研究结果基本一致。

本试验以四季小白菜种子和美国杂交小白菜种子为试验材料，建立了小白菜的离体再生体系，MS+ 0.25 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA为最佳的愈伤组织诱导培养基；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为最佳的不定芽分化诱导培养基；MS+0.2 mg/L NAA为最佳的生根培养基。

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[6] 吕艳艳，王桂萍，沈振国，等.不结球白菜亮白叶再生体系的优化[J].中国农学通报，2010，26（23）：93-96.

[7] 侯喜林，曹寿椿.不结球白菜子叶离体培养再生植株[J].南京农业大学学报，1994，17（3）：60-64.

[8] 秦新民，高成伟.小白菜子叶离体培养再生系统的建立[J].广西师范大学学报，1997，15（4）：90-91.

[9] 邓智年，魏源文，吕维莉，等.小白菜高效子叶离体植株再生体系的建立[J].广西农业科学，2006，37（4）：350-354.

[10] 张 鹏，凌定厚.提高菜心离体植株再生频率的研究[J].植物学报，1995，37（11）：902-908.

[11] 蔡小宁，佘建民.不结球下胚轴和子叶离体培养再生植株[J].江苏农业学报，1995，11（4）：51-54.

[12] 张智奇，周 音.小白菜子叶诱导不定芽再生植株[J].上海农业学报，1998，14（2）：25-28.

[13] 柳 俊，谢从华.植物细胞工程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[14] 赵 慧，侯雷平，王 慧，等.影响小白菜子叶再生的因素[J].分子植物育种，2009，7（5）：972-977.