高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定复方桔梗止咳片中桔梗皂苷D含量

陈国宁，邰顺章，黄柳燕

(1.江苏省盐城市第二人民医院，江苏 盐城 224003； 江苏省盐城市药品检验所，江苏 盐城 224002；3.盐城师范学院，江苏 盐城 224002)

复方桔梗止咳片为镇咳、祛痰的复方中药制剂，由桔梗、远志(蜜炙)、款冬花(蜜炙)、甘草4味中药组方，适用于咳嗽痰多，寒热症状不明显的患者。桔梗功能宣肺、利咽、祛痰、排脓、用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑、肺痈吐脓，是该制剂的主要成分之一。在该制剂中，以桔梗粉碎成细粉入药，桔梗皂苷为桔梗中主要有效成分，桔梗皂苷D是桔梗皂苷的主要皂苷成分。现行质量标准中没有收载该药有效成分含量测定的方法[1]。有采用薄层色谱(TLC)法对该药主要成分进行定性鉴别[2-4]和采用高效液相色谱(HPLC)法测定该药中甘草成分含量[5]的文献报道，2010年版《中国药典》[6]及有关文献中有测定桔梗药材和饮片中有效成分的含量测定方法[7-13]，也有文献报道了对含桔梗中药制剂的有效成分进行含量测定的方法[14-16]。为了有效控制和评价该药的质量，本研究中对该药有效成分的测定方法进行了探索，建立了测定复方桔梗止咳片中桔梗皂苷D含量的高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法，为该药的质量控制与评价提供了科学的方法。现报道如下。

1 仪器与试药

美国Agilent高效液相色谱系统，包括G1311四元输液泵。G1314B紫外检测器、G1329A自动进样器、G1322A真空脱气机、G1316A柱温箱、Agilent 1200色谱工作站；Varian 380-LC型蒸发光散射检测器(美国瓦里安公司)；XS205DU型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；YCQ-300型超声波清洗器(上海凯波超声设备有限公司)。桔梗皂苷D对照品(批号为111851-201204，纯度为94.9%，本品极具引湿性，打开后一次性使用，中国食品药品检定研究院)；复方桔梗止咳片(通化中辰药业有限责任公司，批号分别为 20121206，20121208，20121212，20130309，规格为每片0.25 g；河南羚锐制药股份有限公司，批号分别为120619，121208，规格为每片0.25g)；乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司，批号为1302058)，甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司)，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精密称取桔梗皂苷D对照品52.72 mg，置20 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得桔梗皂苷D对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 mL，用甲醇定容至10 mL，即得对照品溶液。取本品40片，精密称定，研细，称取约15片重，精密称定置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率 40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 mL，置水浴上蒸干，残渣加水20 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液50 mL洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇3 mL使溶解，加硅胶0.5 g拌匀，置水浴上蒸干，加于硅胶柱[100～120目，10 g，内径为2 cm，用三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液湿法装柱]上，以三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液50 mL洗脱，弃去洗脱液，再用三氯甲烷-甲醇-水(60∶20∶3)混合溶液100mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。按处方比例取除桔梗以外的其他药材，以相同工艺制备阴性样品，同法制备缺桔梗的阴性对照品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相:乙腈-水(25∶75)；流速:0.7 mL/min；ELSD 检测器:漂移管温度为90℃，载气为1.8 Bar；进样量:10 μL。理论板数按桔梗皂苷D峰计算应不低于3 000，与相邻组分分离度大于1.5，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

线性关系考察:分别精密量取2.1项下对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，用甲醇分别定容至 10 mL，得系列标准对照品溶液，进样分析。以桔梗皂苷D峰面积对数与质量浓度对数进行线性回归，得回归方程 log(c) =0.621 3 log(a)-0.001 5，r=0.999 78(n=5)。结果表明，桔梗皂昔 D质量浓度在125.08～1 250.8 mg/L范围内的对数值与峰面积对数值呈良好线性关系。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样6次，依法测定。结果桔梗皂苷D峰面积的 RSD为1.47%，峰面积对数的 RSD为0.15%，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批(批号为20121208)样品共6份，依法制备供试品溶液，进样分析。结果每片含桔梗皂苷D的量分别为0.172 9，0.172 5，0.172 1，0.171 5，0.171 4，0.175 3 mg，平均0.172 4 mg，RSD为0.8%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，室温下放置，于15 h内每隔3 h进样1次，共测定6次。结果桔梗皂苷D峰面积的 RSD为1.5%(n=6)，峰面积对数的 RSD为0.17%(n=6)，表明供试品溶液在室温放置15 h内稳定。

加样回收试验:取已知含量的样品(批号为20121208)，置具塞锥形瓶中，共6份，精密加入对照品贮备液1 mL，按2.1项下供试品溶液方法制备溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，计算回收率。结果见表1。

表1 桔梗皂昔D加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取6批样品，依法制备供试品溶液，滤过，进样测定，用回归方程计算样品中桔梗皂昔D的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=6)

3 讨论

样品提取溶剂和提取时间的选择:比较了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、70%乙醇超声提取的效果，结果表明用50%甲醇提取效率最高。比较了不同提取时间(15，20，30，40，60 min)对提取效果的影响，结果超声30 min已基本将组分提取完全。由于样品中有较多的组分可被提取出来，故在处理样品时用水饱和的正丁醇进行提取、分离，并用硅胶柱洗脱、进一步分离。

样品提取方法的选择:对冷浸、超声提取、回流提取、索氏提取4种方法进行了考察，结果表明，超声提取的提取效率较高，同时提取时间短、操作简便易行，故样品制备方法采取用50%甲醇超声提取30 min。

流动相的选择:分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸3种流动相系统的分离效果，结果表明，以乙腈-水(25∶75)为流动相，桔梗皂苷D峰形对称且分离度好，避免了样品中其他组分的干扰。

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