藤三七总黄酮的分离纯化研究

蒋珍藕，邱宏聪，2，邓聿胤

(1.广西中医药研究院，广西 南宁 530022； 广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022)

藤三七为落葵科落葵薯属多年生蔓生藤本植物落葵薯Anredera cordifolia (Tenore)Sreenis.[1]，是一种药食同源的植物，具有滋补强壮、活血化瘀、通脉止痛、调脂降血压的功效，常用于治疗腰膝痹痛、病后体弱、跌打损伤、高脂血症等[2]。药理研究表明，藤三七具有降血糖[3]、抗脂质过氧化[4]、抗菌消炎[5-6]、抗HIV[7]等活性，主要成分为皂苷类和黄酮类化合物[7-8]。本试验中以总黄酮含量为考核指标，采用正交试验优选藤三七总黄酮分离纯化工艺，为深入研究和开发利用藤三七奠定基础。

1 仪器与试药

UV2550型紫外分光光度计(日本岛津公司)；RE-52A型真空旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HH.SY21-Ni型电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；DZF-6051型真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；B2200S型超声清洗机(上海必能信超声有限公司)；LIBROR AEL-200型电子天平(日本岛津公司)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号为080-9002)；乙醇为食用酒精(95%)，购自南宁市广耀实验装备有限责任公司；水为蒸馏水；其余试剂均为分析纯。大孔吸附树脂DM130(西安蓝深特种树脂有限公司)；大孔吸附树脂D101(西安蓝晓科技有限公司)；聚酰胺树脂(30～60目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂，批号为20070706)，聚酰胺树脂(80～100目，上海国药集团化学试剂有限公司，批号为F20081009)，聚酰胺树脂(100～200目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂，批号为20070206)。药材采自南宁市马山县郊区，经广西中医药研究院饶伟源副主任中药师和方鼎研究员鉴定为落葵科落葵薯属多年生蔓生藤本植物落葵薯 Anredera cordifolia(Tenore)Sreenis.(地上部分)，在自然通风条件下阴干。

2 方法与结果

2.1 总黄酮测定

2.1.1溶液制备

取芦丁对照品适量，精密称定，加75%乙醇制成每1mL含150μg的溶液，即得对照品溶液。取藤三七药材粗粉0.5g，精密称定，精密加入75%乙醇25mL，称定质量，超声处理(功率80W，频率50kHz)60min，放冷，再称定质量，用75%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2检测波长选择

取芦丁对照品溶液及供试品溶液适量，以试剂为空白参比液，分别置25mL容量瓶中，加75%乙醇5mL，再加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min。加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min。加1mol/L氢氧化钠试液10mL，再加75%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，在400～800nm波长下扫描。结果芦丁对照品溶液及供试品溶液均在512nm波长处有最大吸收，故选择512nm作为检测波长。

2.1.3线性关系考察

精密称取芦丁对照品12.4mg，置25mL容量瓶中，加75%乙醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液，精密量取 0.5，1，2，4，6，8 mL，以相应试剂为空白参比，分别置 25mL 容量瓶中，按2.1.2项下的显色方法显色，在512nm波长处测定吸光度(A值)。以芦丁质量浓度(μg/mL，X)为横坐标、A值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=0.008 8X+0.0024(r=0.999 4)。结果表明，芦丁质量浓度在 9.92～158.72μg/mL范围内与A值线性关系良好。

2.1.4测定法

取供试品溶液和对照品溶液适量，以相应试剂为空白，分别置25mL容量瓶中，按2.1.2项下的显色方法显色，在512nm波长处测定吸光度并计算。

某高速公路项目全长115km，行车速度设计为100km/h，路基宽度设计为26.0m，本工程路面结构为沥青混凝土结构，主线路面层为（SMA—13）细粒式沥青混凝土面层，厚度为4cm；中面层为6cm（AC—20C）中粒式沥青混凝土；下面层为8cm（AC—25C）粗粒式沥青混凝土。在本项目路面排水设计中主要采用中央分离带、超高缓和段的排水处理方法，最大限度减少平坡路段出现积水的现象。但是在实践过程中，采用该方式不能达到理想的防排水效果。基于此，相关部门在研究后从问题角度出发，在了解高速公路防排水设计应用实际的基础上，采取了优化设计方式进行。

2.2 分离纯化工艺研究

2.2.1藤三七提取液制备

取藤三七药材粗粉2kg，加12倍量75%乙醇回流提取2次，每次2h，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水定容至2000mL，摇匀(即药材含量为1 g/mL，测定总黄酮浓度为45.42g/L)，备用。

2.2.2树脂预处理

取树脂，用95%乙醇溶液浸泡树脂24 h，充分溶胀后用湿法装柱，用95%乙醇以2 BV/h(B为倍，V为树脂体积)的流速清洗，至流出液与水混合(1∶5)不呈白色混浊为止，再用蒸馏水清洗柱子至流出液无醇味，备用。量取树脂时以树脂在水中溶胀后的体积(mL)为单位。

2.2.3树脂筛选

选择2种不同型号(DM130，D101)的大孔吸附树脂和3种不同规格(30～60，80～100，100～200目)的聚酰胺树脂对藤三七中黄酮的吸附-洗脱性能进行筛选试验，优选出对藤三七黄酮成分具有较好吸附洗脱性能的树脂。取2.2.1项下藤三七提取液25 mL，加水至250 mL，搅匀，放置 24 h，滤过，滤液均分5份，作为上样液。量取已处理好的上述5种树脂各20 mL，分别用湿法装柱，取上述上样液以同样流速分别上柱吸附，收集流出液，蒸干，测定其总黄酮含量，计算总黄酮吸附量[总黄酮吸附量(mg)=样品总黄酮量-流出液总黄酮量]。然后分别用50%乙醇50 mL以同样的洗脱流速进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，测定其中的总黄酮含量，计算洗脱率。洗脱率(%)=洗脱液总黄酮量/总黄酮吸附量×100%。结果见表1。结果表明，聚酰胺树脂(30～60目)的总黄酮吸附量和洗脱率均高于大孔吸附树脂DM130和D101。80目以上的聚酰胺树脂由于其树脂粉末过细，流速极慢，甚至产生了堵塞，试验中不好操作，结果放弃试验。因此，综合考虑各树脂的吸附-洗脱性能及试验操作的可行性，选择30～60目的聚酰胺树脂作为藤三七总黄酮分离纯化的适用树脂。

表1 不同吸附树脂的吸附-洗脱性能测定结果

2.2.4吸附条件优选

表2 吸附条件优选因素水平表

表3 吸附条件优选 L9(34)正交试验结果

表4 吸附条件优选方差分析表

2.2.5上样量(药材树脂比)选择

取2.2.1项下藤三七提取液5 mL，共2份，按上述正交试验优选的吸附条件上柱，收集流出液，蒸干，测定其总黄酮含量，并计算饱和吸附量。饱和吸附量(g/L)=(样品总黄酮量-流出液总黄酮量)/树脂体积。结果2份样品平均饱和吸附量为4.62g/L，即每1 mL聚酰胺树脂(30～60目)对总黄酮的饱和吸附量为4.62mg(约相当于 0.1g药材)，因此，上柱总黄酮量(mg)与所用树脂(mL)的比例应低于4.6∶1(即相当于0.1g(药材)/mL树脂)。

2.2.6洗脱条件优选

以总黄酮洗脱率为考察指标，采用正交试验，优选聚酰胺树脂(30～60目)对藤三七总黄酮的最佳洗脱条件。根据预试验和参考有关柱色谱法分离纯化文献[10-11]，选取洗脱剂乙醇浓度(因素A)、洗脱剂乙醇用量(因素B)、洗脱流速(因素C)作为考察因素，每个因素设计3个水平，按L9(34)正交试验表进行试验，因素水平见表5。取2.2.1项下藤三七提取液5mL，共9份，按上述正交试验优化条件吸附后的树脂，按正交设计表进行试验，收集洗脱液，减压浓缩，真空干燥，测定其中的总黄酮含量，并计算洗脱率。洗脱率(%)=洗脱液总黄酮量/(样品总黄酮量-吸附后滤液总黄酮量)×100%。结果见表6，方差分析见表7。经直观分析和方差分析正交试验结果，影响洗脱的因素主次顺序为A＞B＞C，即洗脱剂乙醇浓度＞洗脱剂乙醇用量＞洗脱流速，但影响均无显著性，最佳洗脱工艺条件为A2B2C2，即乙醇浓度为50%，乙醇用量为10 BV，洗脱流速为2 BV/h。

表5 洗脱条件优选因素水平表

表6 洗脱条件优选 L9(34)正交试验结果

2.3 验证试验

取2.2.1项下藤三七提取液100 mL，共3份，分别按上述正交试验优化的吸附、洗脱条件进行试验。结果干膏中总黄酮含量分别为58.92%，56.67%，57.74%，RSD为1.95%，表明藤三七乙醇提取液经聚酰胺树脂(30～60目)分离纯化后，干膏中总黄酮含量达50%以上，且重现性较好。

表7 洗脱条件优选方差分析表

3 讨论

聚酰胺树脂对黄酮类成分具有较好的特异性吸附和解吸性能，可以使黄酮类成分得到有效分离和纯化，笔者也曾用聚酰胺树脂分离纯化木姜叶柯总黄酮[12]，得到含量较高的总黄酮，本试验再次用聚酰胺树脂分离纯化藤三七总黄酮，总黄酮含量达50%以上。

藤三七含有较多的黏液质，因此藤三七提取液上柱前一定要选择适宜的滤材滤过，或离心后取上清液，否则容易造成柱子堵塞，影响藤三七总黄酮的分离纯化。

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