一株可降解孔雀石绿的肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

李媛++张立强

摘要：孔雀石绿是一种具有致癌致畸作用的环境污染物。从武昌理工学院污水处理厂的活性污泥中分离得到一株可降解孔雀石绿的细菌，命名为MG-1。生理生化试验分析初步鉴定该菌为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），进一步的序列分析显示该菌16S rDNA与肺炎克雷伯氏菌MBR11菌株的16S rDNA一致性达99%，进一步证明该菌为肺炎克雷伯氏菌。试验证实肺炎克雷伯氏菌具有降解孔雀石绿的特性，其降解机理还有待于做进一步研究。

关键词：孔雀石绿；肺炎克雷伯氏菌；16S rDNA

中图分类号：S949 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）02-0298-03

Isolation and Characterization of a Malachite Green-degrader Klebsiella pneumoniae

LI Yuan1，ZHANG Li-qiang2

（1.Wuhan Environmental Monitoring Center，Wuhan 430015， China；2.Institute of Fishery Research of Wuhan City，Wuhan 430207，China）

Abstract： Malachite Green is a type of environmental pollutant inducing cancer and abnormality. A bacterium with the capability of degrading malachite green was isolated from the sludge sample collected from wastewater system of Wuchang university of Technology and designated as strain MG-1. According to the physiological-biochemical characteristics， it was preliminarily identified as Klebsiella pneumoniae. The 16S rDNA sequence analysis revealed that it has 99% homology with Klebsiella pneumoniae strain MBR11. All the data indicated that it was a Klebsiella pneumoniae stain. A further study is needed to explore the degradation mechanism.

Key words： Malachite Green； Klebsiella pneumoniae； 16S rDNA

孔雀石绿（C23H25ClN2，Malachite Green，MG）是一种合成的三苯甲烷类工业染料，被广泛用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂等领域[1]，也可用来治疗各类水生动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等[2-4]。但是研究表明，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿在鱼体内和环境中残留时间长，它们分子中含有的化学官能团——三苯甲烷被确证具有高毒、高残留、“三致”等毒副作用[5，6]。在2002年5月农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》上，孔雀石绿属于禁用药物。由于中国的水产养殖曾经长期使用孔雀石绿，导致水环境的严重污染，因此借助有效的工具消除环境中积累的孔雀石绿就显得十分必要。以微生物降解为基础的生物修复技术是消除环境中孔雀石绿污染的有效方法。 目前已报道的孔雀石绿降解菌主要有细菌中的假单胞菌（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、节杆菌（Arthrobacter sp.）等[7-12]，但鲜见克雷伯氏菌属（Klebsiella）的细菌降解孔雀石绿的报道。本研究从武昌理工学院污水处理厂的活性污泥中分离到1株能降解孔雀石绿的细菌，通过16S rDNA序列鉴定为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。该菌株的获得丰富了孔雀石绿降解菌株的多样性，并为孔雀石绿污染废水的处理提供了菌株资源。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

1.2 菌株筛选

1.3 菌株生化鉴定

菌株培养于LB培养基平板上，30 ℃培养24 h，取固体斜面的新鲜培养物，经革兰氏染色后，用光学显微镜观察菌落形态； 其他各项生理生化试验参照文献[14]进行； 根据细菌的形态特征及生理生化反应参照文献[15]鉴定至种。

1.4 菌株分子学鉴定

2 结果与分析

2.1 菌株分离与生化鉴定结果

2.2 菌株16S rDNA基因序列分析

以菌株的基因组DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因通用引物16S rDNA-F、16S rDNA-R进行PCR扩增，得到长度为1 532 bp的扩增产物（图1）。将此序列用Blast进行比对，结果显示该序列与肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）编号为MBR11的菌株的16S rDNA一致性（Identities）达99% （图2）。目前细菌分类学家普遍认为当某2个细菌的16S rRNA一致性大于95%时，可将其归为同一属[14]。根据上述相似性比较结果，再结合生理生化特性将该菌株鉴定为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）

3 讨论

孔雀石绿作为一种染料及渔用杀菌剂曾在中国广泛使用，然而大量研究表明孔雀石绿及其代谢产物具有致癌致畸作用，目前中国已经将其列为渔类养殖禁用药物，但是已经在环境中积累及违法使用的孔雀石绿污染物依然存在，并且将长期危害环境。微生物降解孔雀石绿是一种既经济又实用的生物学手段。本研究分离到一株降解菌MG-1，经过生理生化分析并结合16S rDNA基因序列相似性分析将其初步鉴定为Klebsiella sp.，其降解机理有待进一步研究。

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