市售蕲蛇样品的传统鉴定与分子生物学鉴定特征

刘晓青

沙河市人民医院药剂科，河北 沙河 054100

市售蕲蛇样品的传统鉴定与分子生物学鉴定特征

刘晓青

沙河市人民医院药剂科，河北 沙河 054100

目的：探讨不同方法对市售蕲蛇样品真伪特征鉴别结果的准确性。方法：对来自不同销售公司蕲蛇样品分别采用传统鉴别方法和分子生物学方法进行鉴定。结果：采集三个城市医药销售公司共30个蕲蛇样品，传统外观和显微镜方法鉴定30个样品中有25个正品，5个伪品，合格率为83.3%；用分子生物学方法从市售蕲蛇样品中抽提线粒体D N A，采用PCR方法进行特异性引物扩增。30个蕲蛇样品中合格品20个，不合格品10个，合格率为66.67%。结论：传统鉴别方法鉴别市售蕲蛇样品特异性较低，分子生物学方法检测简单、准确、快捷，对规范市售蕲蛇中药材市场具有广阔前景。

蕲蛇；鉴定；PCR技术

蕲蛇作为药用资源，始载于宋代寇宗爽的《开宝本草》，在我国已有2千多年的应用历史。生物学分类蕲蛇属脊索动物门爬行纲蝰科（Viperidae）动物五步蛇Agkistrodon acudus（Guenther），药材为除去其内脏的干燥体。主要产自浙江省温州、丽水、金华地区，江西、福建、广西等地亦产。具有祛风，通络，止痉的功效。主要用于风湿痹痛、麻木拘挛、中风、半身不遂、破伤风、抽搐痉挛、皮肤疥癣等。由于蛇类资源遭到过度破坏，本品市场较为紧缺，价格昂贵，市售商品中普遍存在伪品、混淆品、掺假品。近年来蕲蛇伪品造假手段越发高明，仅根据形态学特征来鉴别已不能满足市场需要［1-2］。本研究通过采用传统鉴定方法与分子生物学方法对市售蕲蛇样品进行鉴别，以探讨不同方法对市售蕲蛇样品真伪鉴定的准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 TGL-16G台式高速离心机（上海医用仪器厂）；H-2050 R型台式低温高速离心机（美国Beckman公司）；S H A-B型水浴恒温振荡器（江苏金坛医疗仪器厂）；D Y Y-8 B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；9700型PCR扩增仪（美国A B I）；UVWHITE2020D凝胶成像分析系统（美国Biorad公司）。

1.2 药材与试剂 正品蕲蛇（中国药品生物制品研究所提供并鉴定）；30个市售蕲蛇样品分别来自郑州、开封、洛阳三地医药经销公司，每个公司随机抽样10个蕲蛇样品；裂解液［10mmol/LTris-Cl（p H7.6）、10mmol/LNa2EDTA，50mmol/LNaCl］；蛋白酶K（20mg/m L）；SDS（1 0%）；饱和醋酸钠、异丙醇、乙醇、TaqDNA聚合酶、游离脱氧核苷三磷酸dNTPs；琼脂糖凝胶（西班牙Agarose公司）；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 传统鉴别方法

2.1.1 外观 正品蕲蛇判断参见文献［3］方法。呈圆盘状，盘径1 7～3 4c m，全体具鳞片。头在中央稍向上，呈扁三角形，吻端向上突出，习称“翘鼻头”，眼后至颈侧有一条黑色斑纹，口宽大，上颚有1对毒牙；背部红棕色，有2 4个灰白色菱方形斑纹，习称“方胜纹”；腹部灰白色，鳞片较大，有多数类圆形黑斑，习称“连珠斑”；尾部骤细，末端有三角形深灰色的角质鳞片1枚，习称“佛指甲”；气腥，味甘咸。

2.1.2 显微镜鉴别［4］

2.1.2.1 碎片 粉末黄白色或淡黄色。角质鳞片特征：近无色或淡黄色角质鳞片，表面观呈类圆型、卵圆形或类多角形隆起，覆瓦状排列，侧面观呈半圆形或乳头状突起，散在淡灰色或淡棕色细颗粒状物分布；表皮细胞特征：界限不清楚，密布暗棕色色素颗粒，多聚集成不规则网状或分枝状；横纹肌特征：纤维较多无色或淡黄色，多碎断；侧面观呈薄片，边缘较平直，横纹细密平直或微波状，明暗相间有的不清晰；横断面呈圆形或类椭圆形，有小孔或裂隙；骨碎片呈不规则，骨陷窝类圆形或梭形，多呈同方相排列，骨小管较细，有细密的斜向排列纹理。

2.1.2.2 背鳞 鳞片呈深棕色或黄棕色，密布乳头状突起，乳突呈类三角形。类卵圆形或不规则形，内含颗粒状色素；横切面部分真皮和表皮向外乳头状突起，外表面呈波浪状形，突起部真皮含较多色素；内表面较平直，没有乳头状突起。

2.2 分子生物学方法

2.2.1 模板DNA提取 取蕲蛇样品剪碎至1m m3左右，称取样品0.0 5g加入5 0 0μL裂解液，3 0μL1 0%S D S，1 5μL蛋白酶K，混匀后置于5 6℃水浴振荡1 6～1 8小时。取出加入5 0 0 μL饱和醋酸钠，轻轻振荡1 0分钟，4℃1 1 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n，取上清液加入等体积异丙醇，-2 0℃放置1小时；取出4℃1 1 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n，弃上清液，向沉淀中加入2 0 0 μL 7 0%乙醇充分冲洗，4℃1 1 0 0 0 r/m i n离心1 0 m i n，留沉淀室温干燥；加入8 0μL灭菌双蒸水溶解D N A，作为供试品模板进行P C R反应。

2.2.2 PCR反应 反应体系为3 0μL，包括1 0×P C R缓冲液2.5μL，d N T P（2.5m m o l/L）2μL，引物（1 2.5 μm o l/L）各0.5 μL，模板（包括阳性对照品、供试品、阴性对照品）0.5 μL，T a qD N A聚合酶（1 U/μL）1 μL，加双蒸水补至3 0 μL，加入2 0 0 μL反应管中；将反应管置P C R仪，P C R反应参数为9 5℃预变性5 m i n，循环反应3 0次（9 5℃3 0 s，6 3℃4 5 s，7 2℃3 0 s，7 2℃延伸5 m i n）。P C R结束后在1小时内进行检测。

2.2.3PCR反应鉴定 取P C R扩增后的反应管中液体1 0～1 5 μL与上样缓冲液3～5 μL充分混匀，点在含E B染色剂的1%的琼脂糖凝胶点样孔中，电泳2 0～3 0 m i n（1 0 V/c m），至蓝色指示剂距点样孔2～4 c m时结束电泳，将凝胶置于紫外分析仪上观察，拍照。

2.3 结果

2.3.1 传统方法检测 传统鉴别方法鉴定3 0个样品，有2 5个正品，5个伪品，合格率为8 3.3%。

2.3.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱 若在与阳性对照（2 0 0～3 0 0 b p）同一位置处出现条带且阴性对照无条带，则样品为正品蕲蛇（图1—3）。3 0个蕲蛇样品中合格品2 0个，不合格品1 0个，合格率为6 6.6 7%。

图1开封地区市售蕲蛇样品PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

图2 洛阳地区市售蕲蛇PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

图3 郑州地区市售蕲蛇PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图谱

3 讨论

蕲蛇作为我国传统名贵中药，需求量较大。为了获取暴利，商贩对蕲蛇药材的造假办法层出不穷，传统的鉴别方法已经不能满足市场需要。因此，了解市场蕲蛇药材质量情况具有重要意义。本研究通过对本院来自3个城市的30个蕲蛇样品进行质量分析，传统方法结果表明合格率为83.3%，采用分子生物学检测法检测合格率为66.6%。说明本地区蕲蛇样品质量需要进一步规范。

蕲蛇常见掺假品主要有死后变质的蕲蛇加工干燥品；鲜蕲蛇剖腹后在蛇身皮下掺入异物在盘圆定型；利用餐厅食用蕲蛇去掉的头皮尾，贴在去头皮尾的杂蛇身上，定型干燥而成［5］。

常见的伪品及混淆品包括百花锦蛇、眼镜蛇、银环蛇、金环蛇、滑鼠蛇、烙铁头、山烙铁头等［6-8］。百花锦蛇为游蛇科动物百花锦蛇的干燥体。呈圆盘状，头盘于中央，呈方圆形，先端较窄，无颊窝；头背有对称大鳞，体背部灰黑色；脊部有深褐色的大斑纹交错排列；背鳞平滑或微具棱，体中部有鳞片2 7行，尾较长，尾端无角质鳞片；气腥，味微咸。眼镜蛇为眼镜蛇科动物眼镜蛇的干燥体。呈圆盘状，头盘于中央，呈椭圆形而扁平，颈部有浅色不规则的“眼镜状”斑纹；上唇鳞7枚，口内具沟状牙；头背有对称大鳞片，背部黑褐色，有单或成双排列的波状横斑纹，背鳞中段2 1行，平滑；腹部灰白色，尾细。金环蛇为眼镜蛇科动物金环蛇的干燥体；呈圆盘状，头盘于中央，呈椭圆形而略圆；上唇鳞7枚，口内具沟状牙；头背有对称大鳞片；头背和背部棕褐色，有金黄色宽4～5鳞片的横斑纹，背鳞中段15行，平滑，尾下鳞单行，尾细。银环蛇为眼镜蛇科动物银环蛇的干燥体。呈圆盘状，头稍大于颈且头在中央，尾细常纳于口内；鼻鳞2片，鼻孔椭圆形；体鳞光滑，全身概为15列，背部中央的1行鳞片特别大，呈六角形；腹鳞200～218行，肛鳞l片，尾下鳞单行，40～51片；尾细长而尖，体黑色，腹部白色，略有灰黑色小斑点；气微腥，味微咸。滑鼠蛇为游蛇科动物滑鼠蛇的干燥体。呈圆盘状，头盘于中央，呈椭圆形，无颊窝；口内上颌全为同型邪齿，上唇鳞8枚；头背黑褐色，有对称大鳞，体背部横棕色，有无规则的黑色横斑；背鳞平滑，体中部有鳞片1 7行；尾较长，尾端无角质鳞片。

中药材的传统鉴别方法是利用每种药材的特别之处，或观其形，或辨其色，或尝其味，或感其质，或兼而有之，言简意赅，传神易记。这种传统经验鉴别方法简便易行，不需要特殊的设备条件，在临床广泛应用，尤其适宜于不具备现代中药鉴别设备的基层医疗单位推广应用，能有效防止以假充真，以劣充优的情况发生，从而保证临床用药的安全［8］。但是，一方面由于性状特征是原植物（原动物）形态特征的广义延伸，多少保留了部分原植物的形态和结构等信息，因此性状特征一致的药材出现假药的概率相对小一些。其中有一部分中药材和中药饮片的性状特征突出，它们保留了原植物（原动物）明确的物种信息，单纯凭一片饮片或药材的性状特征就能鉴定到物种。另一方面，由于中药材及其饮片大部分只是药用植物或动物的一部分，而且经过净制、切制、干燥、加工和炮制等，在此过程中失去很多代表来源物种的信息，增加了其物种鉴定的难度，因此大部分中药单凭性状很难准确确定品种，还需要辅助其他方法，以保证鉴定结果的准确性。

大量实验证明分子生物学方法在药材质量控制领域有广阔的发展前景，已广泛应用于中药材的鉴定［9］，其中，蕲蛇的分子生物学鉴定已列入中国药典（2010）［10］。该方法简单、准确、快捷，能够满足当今蕲蛇药材市场检测的要求。

［1］冷爱晶.蕲蛇及其伪品的鉴别［J］.时珍国医国药，2003，14（3）：154.

［2］玉凝，李军，高翔，等.中药鉴定学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：211.

［3］陈志清.蕲蛇的真伪鉴别和鉴别要点［J］.中国民族民间医药，2012，16（2）：50-51.

［4］柳伟.蕲蛇及其掺伪品的鉴别［J］.时珍国医国药，2006，17（5）：787-788.

［5］Chen Y C，W u X F，Zhao E.Cl assi fi cat i on of agki st rodon speci es i n Chi na［J］.Toxi con，1984，22（1）：53-61.

［6］陈晓红.基层医院采购蕲蛇如何鉴别其真伪［J］.陕西中医，2009，30（10）：1397-1398.

［7］唐晓晶，冯成强，黄璐琦，等.蕲蛇及其混淆品高特异性PCR鉴别［J］.药物分析杂志，2006，26（2）：152-155.

［8］Wang Yiquan，Zhou Kaiya，XU Luoshan，etal.Sequenci ng of Cytb gene fragm ent s and PCR i dent i fi cat i on of "j i nqi an bai huashe"（Bungrus parvus）and i t s adult erant s［J］.Y ao X ue X ue Bao，1988，33（12）：941-947.

［9］宋文成，宋社吾，刘道芳，等.蕲蛇药材及其市售混淆品的Cyt b基因序列与分析［J］.中草药，2006，12：1862-1865.

［10］中华人民共和国国家药典委员会.中国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：361.

Characteristics of Commercial Ancistrodon Acutus Identified by Traditional Method and Molecular Biology

LIU Xiaoqing
Department of Pharmacy of Shahe Municipal People′s Hospital，Shahe 054100，China

Objective：To investigate the accuracy of different methods in distinguishing commercial ancistrodon acutus.Methods：The samples from different companies were identified with traditional method and the method of molecular biology respectively.Results：Altogether 30 kinds of samples from three pharmaceutical companies were collected.the results showed that there were 25 kinds of authentic ones and five counterfeit ones，qualification rate was 83.3%；DNA of mitochondria were extracted from the samples by the method of molecular biology，specific primers were amplified by PCR method.There were 20 kinds of qualified goods and ten kinds of unqualified ones，qualification rate was 66.67%.Conclusion：Traditional identification method is of low specificity，the method of molecular biology is simple，accurate and rapid，it demonstrates broad prospect to regulate the marketing of ancistrodon acutus.

ancistrodon acutus；identification；PCR technique

R282.5

A

1004-6852（2014）05-0016-03

2013-07-20

刘晓青（1971—），女，副主任药师。研究方向：药品鉴定。