附子干姜配伍对阿霉素致大鼠慢性心衰的治疗作用

梁 涛 耿 珊 周玲玲 葛华雯 王新宇

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

附子干姜配伍对阿霉素致大鼠慢性心衰的治疗作用

梁 涛 耿 珊 周玲玲 葛华雯 王新宇

（南京中医药大学，江苏 南京 210023）

目的 观察附子干姜配伍治疗阿霉素（ADR）致慢性心衰的作用，并探讨其作用机理。方法 采用盐酸ADR腹腔注射方法，建立慢性心力衰竭大鼠模型，将SD大鼠随机分为6组：对照组，模型组，附子高、低剂量组（3.3，1.65g/kg），附子干姜（1∶1）高、低剂量组（6.7，3.3g/kg）。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清中去甲肾上腺素（NE）、内皮素-1（ET-1）和心脏组织中Na+-K+-ATPase的活性，运用蛋白免疫印迹杂交法（Western Blot）检测心脏组织蛋白Junctophilin-2（JP2）的蛋白表达。结果 与模型组比较，附子和附子干姜配伍血清中NE及ET-1含量显著降低，心脏组织中Na+-K+-ATPase含量及JP2的蛋白表达显著升高，其中附子干姜（1∶1）高剂量组作用更显著（P＜0.01）。结论 附子与附子干姜（1∶1）配伍对ADR致慢性心衰的作用，可能与其增加心脏组织Na+-K+-ATPase活性，上调Junctophilin-2（JP2）的蛋白表达有关。

附子 干姜 阿霉素 心力衰竭

慢性心力衰竭（CHF）是一组复杂的临床综合征，是多种心脏疾病的终末期表现。ADR是一种广谱高效的蒽醌类肿瘤化疗药物，对白血病、淋巴瘤等多种肿瘤的化疗效果良好。长期大剂量使用会引起中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，甚至出现严重的心力衰竭［1］。在近几年关于治疗慢性心衰药物的研究报道中，大多数是附子干姜配伍在抗氧化应激，凋亡等方面的研究，对慢性心衰作用的发生机制并不明确。本实验通过附子干姜配伍探究其治疗ADR致慢性心衰的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠，雌雄各半，体质量200～220g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司［SCXK（沪）：2007-0005］提供。自由饮水，室温（20±2）℃，湿度50％～60％。SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只，即对照组、模型组、附子高剂量组（3.3g/kg）、附子低剂量组（1.65g/kg）、附子干姜（1∶1）高剂量组（6.7g/kg）、附子干姜（1∶1）低剂量组（3.3g/kg）。对照组及模型组在造模同时每日灌胃0.9％氯化钠注射液，两附子组，附子干姜（1∶1）组等体积灌胃给药，每日1次，连续16d，给药体积1mL/100g。

1.2 试剂与仪器 附子（黑顺片）、干姜原药材购于南京解放军第四五四医院药剂科，质量符合《中国药典》2010版一部规定；注射用盐酸ADR，浙江海正药业股份有限公司，批号：111003；内参一抗（β-Actin），Immunoway；二抗（羊抗兔IgG-HRP），Jackson，批号111-035-003；Noradrenaline（NE）测定试剂盒、Endothelin 1（ET-1）测定试剂盒、Na+-K+-ATPase测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；全蛋白抽提试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司）；ECL检测试剂盒，南京鹭飞生物技术有限公司。附子高剂量：称取附子500g，加10倍量水浸泡30min，煎煮1h过滤，连续煎煮3次，合并3次滤液，于水浴锅上浓缩至1.5L，即每mL相当于生药0.33g。附子低剂量：取附子高剂量，稀释1/2。附子干姜（1∶1）高剂量：称取附子、干姜各500g，加10倍量水浸泡30min，煎煮1h过滤，连续煎煮3次，合并3次滤液，于水浴锅上浓缩至1.5L，即每mL相当于生药0.67g。附子干姜（1∶1）低剂量：取附子干姜高剂量，稀释1/2，得附子干姜水煎液低剂量。电子天平，天津市天马仪器厂，型号TD6001；分析天平，上海精科天美科学仪器有限公司，型号FA1204B；华东电子酶标仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司，型号DG5033A；Western电泳仪，美国Bio-Rad，型号164-5051；PVDF膜，PALL，型号65421；高速冷冻离心机，美国科俊仪器公司，型号SH03014；电热恒温干燥箱，上海润东荣丰科学仪器有限公司，型号101-AS-3；多用脱色摇床，江苏金坛市正基仪器厂，型号HY-4。

1.3 模型制备 参照文献进行改进［2］，采用盐酸ADR造模，腹腔注射盐酸ADR，剂量分别为1，1.5，2，2.5mg/kg，每个剂量给药2次，共8次，累计剂量14mg/kg，隔日1次，持续16d。

1.4 实验方法 Western Blot方法测定：JP2的蛋白表达参照文献［3-4］将样本进行SDS-PAGE凝胶电泳。经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，蛋白质采用湿电转移法转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭液封闭（室温，1h），弃去封闭液。按约0.1mL/cm2的量加入封闭液和适量一抗junctophilin2抗体（abcam公司，ab110056）、β-actin（abcam公司，ab8227）抗体（1∶4000）。将膜与HRP结合的二抗（辣根过氧化酶标记抗体，二抗用封闭液1：5000稀释）室温下摇荡孵育用PBST充分洗膜，漂洗5次，每次5min。采用ECL化学发光试剂盒，显影定影，对胶片灰度扫描。应用BIO-RAD图像分析软件对Western blot杂交条带进行扫描，以JP2蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示组织中JP2蛋白表达水平。

1.5 指标的检测 血清中NE、ET-1测定：灌胃给药第17日，颈总动脉取血3000r/min，离心10min，取血清，采用Elisa法测定血清中NE、ET-1的含量。心脏组织中Na+-K+-ATPase活性测定：称取心脏，制成10％的组织匀浆，2500r/min，离心10min，取上清，采用Elisa法测定心脏组织匀浆中Na+-K+-ATPase的活性。

1.6 统计学处理 应用SPSS统计学软件进行单因素方差分析，实验数据均以（±s）表示，组间进行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 附子干姜配伍对心衰大鼠血浆中NE和ET-1、心脏组织中Na+-K+-ATPase含量的影响 见表1。实验结果表明，与模型组相比，附子干姜（1∶1）高剂量组NE含量显著降低，附子高剂量组，附子干姜（1∶1）高及低剂量组ET-1的含量显著降低，心脏组织中Na+-K+-ATPase附子高剂量组，附子干姜（1∶1）高、低剂量组显著升高，其中附子干姜（1∶1）高剂量组变化更为显著（均P＜0.05或P＜0.01）。

表1 附子干姜对心衰大鼠心脏组织中Na+-K+-ATPase和血清NE、ET含量影响（±s）

表1 附子干姜对心衰大鼠心脏组织中Na+-K+-ATPase和血清NE、ET含量影响（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

分组 n对照组 10模型组 10附子高剂量组 10 Na+-K+-ATPase（U/mgprot）NE（ng/L）ET-1（ng/L）0.81±0.15** 73.28±10.43*39.86±3.23**0.34±0.09 87.84±3.14 51.17±2.96 0.45±0.07* 80.63±8.63 43.21±5.12*附子低剂量组 10 0.43±0.08 83.55±7.90 44.92±5.45附子干姜（1∶1）高剂量组 10 0.68±0.10** 76.10±8.34*43.28±3.12**附子干姜（1∶1）低剂量组 10 0.50±0.09* 79.40±9.51 45.40±3.29*

2.2 附子干姜配伍对心衰大鼠心脏组织中JP2蛋白表达的影响 见表2。与模型组相比，附子高剂量组，附子干姜（1∶1）高、低剂量组大鼠心脏组织中JP2的蛋白表达都有所上调，其中附子干姜（1∶1）高剂量组JP2的蛋白表达上调更显著（P＜0.01）。

表2 附子干姜对心衰大鼠心脏组织中JP2蛋白表达影响（±s）

表2 附子干姜对心衰大鼠心脏组织中JP2蛋白表达影响（±s）

分组 n对照组 10模型组 10附子高剂量组 10 Junctophilin-2（JP2）蛋白表达1.04±0.03**0.22±0.04 0.58±0.13*附子低剂量组 10 0.42±0.11附子干姜（1∶1）高剂量组 10 0.66±0.05**附子干姜（1∶1）低剂量组 10 0.51±0.09*

3 讨论

心力衰竭时心脏去甲肾上腺素转运蛋白介导的NE再摄取功能遇到障碍，细胞外间隙NE的长期慢性持续性蓄积，导致肾上腺素能受体过度激活，并诱导心肌肥厚和心室重构［5］。ET-1是机体内一种强烈的缩血管物质，由血管内皮细胞和心肌细胞等分泌产生。ET-1可促进心肌细胞、血管平滑肌细胞等合成和释放AngⅡ，并可促进心脏成纤维细胞的增殖和胶原的合成。研究发现，慢性心衰可伴有ET-1水平的增高［6］。综上所述在慢性心衰发生时，NE和ET-1含量都是有所升高，可以看作它的一种判定指标。

图1 附子干姜对心力衰竭大鼠JP2蛋白表达的影响

Na+-K+-ATPase广泛分布于细胞膜上，在CHF的病理生理过程中，Ca2+调节的改变是各种机制的中心环节，心肌细胞膜Na+-K+-ATPase的蛋白水平和活化程度是细胞内Ca2+稳态的关键因素。经研究表明，CHF时Na+-K+-ATPase活性降低，细胞内Na+升高，Na+-K+交换增强，导致线粒体功能障碍，ATP生成减少，依靠能量的质膜及肌浆膜Ca2+-ATPase因能量不足不能将肌浆过多的Ca2+泵出或摄入肌浆网，致使心肌细胞出现钙超载［7］。本次实验结果中显示，附子、附子干姜（1∶1）配伍组Na+-K+-ATPase活性都有所增加，其中附子干姜（1∶1）高剂量组活性增加更明显，这为附子干姜配伍产生的强心作用比附子的更显著提供了理论依据。附子干姜配伍的强心作用可能与心脏组织中Na+-K+-ATPase活性变化有关。

Junctophilin蛋白是维持细胞膜与内质网/肌质网（ER/SR）膜联接复合物的关键分子。研究表明，JP2通过N端附近的重复MORN结构域与细胞膜相互联结，并通过C端锚定于肌质网［8］，JP2是维持二联体结构稳定的基础，对维持钙致钙释放分子耦联效率起着至关重要的作用［9］。在心肌肥厚和心力衰竭过程中，JP2的表达水平显著降低，并且二联体结构受到损害［10］。本次实验结果显示，附子、附子干姜（1∶1）各剂量组大鼠心脏组织中JP2蛋白表达上调，其中附子干姜（1∶1）高剂量组大JP2蛋白表达上调更显著，其强心机理可能与JP2蛋白表达上调有关。

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Study on the Compatibility of Aconite and Dried Ginger Treating Rats with Adriamycin-induced Chronic Heart Failure

LIANG Tao，GEN Shan，ZHOU Lingling，et al.
Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China

Objective：To study the compatibility of aconite and dried ginger treating rats with adriamycin-induced chronic heart failure and to explore its mechanism.Methods：Hydrochloride adriamycin injection was applied to establish an chronic heart failure animal model.SD rats were randomly divided into 6 groups：normal group，model group，aconite high and low dose groups（3.3，1.65g/kg），and aconite and dried ginger（1∶1）high and low dose groups（6.7，3.3g/kg）.The content of NE and ET-1 in rat serum and activity of Na+-K+-ATPase in cardiac tissue were detected by ELISA.JP2 protein expression in heart tissue was detected by western blot.Results：Compared with model group，the levels of NE and ET-1 in serum significantly decreased while the activity of Na+-K+-ATPase and expression of Junctophilin-2（JP2）protein in cardiac tissue significantly increased.Compatibility of aconite and dried ginger（1∶1）had more significant effect on the high dose group.Conclusion：Compatibility of aconite and dried ginger treating adriamycin-induced chronic heart failure may relate to increasing activity of Na+-K+-ATPase and enhancing expression of Junctophilin-2（JP2）protein.

Aconite；Dried ginger；Adriamycin；Heart failure

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1821-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.018

2014-07-02）

南京中医药大学国家基金预研基金科研课题（12XYY08）