紫杉醇提取及分离纯化技术研究进展

常杰华　张万忠

摘要 紫杉醇是从红豆杉属植物分离出来的一种具有独特抗癌机制的二萜类化合物，紫杉醇因其独特的抗癌机理及其显著疗效而倍受重视。目前紫杉醇主要来自于红豆杉属植物中，提取和分离纯化技术是从红豆杉属植物中获得紫杉醇必须的技术手段。在此较为全面地论述了近年来国内外紫杉醇的提取纯化技术。

关键词 紫杉醇；提取；分离纯化；技术；研究进展

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03388-03

Abstract Paclitaxel is a kind of two terpenoids with unique antitumor mechanism isolated from Taxus plants， attracted the attention because of its unique anticancer mechanism and remarkable curative effect. Taxol are mainly from Taxus plants， extraction and separation， purification technology is the necessity mean for obtaining taxol from Taxol plants. The extraction and purification technologies for Paclitaxel at home and abroad in recent years were elaborated.

Key words Taxol； Extraction； Separation and purification； Technology； Research progress

紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是一种二萜类化合物，具有独特的抗癌机理，是近30年来发现的重要抗癌药之一[1-2]。目前，红豆杉属植物仍是获得紫杉醇的主要来源，从红豆杉中直接提取分离或以分离提取的紫杉醇结构类似物为原料合成紫杉醇是获得紫杉醇的主要途径。迄今，紫杉醇主要还是从天然和人工栽培红豆杉的枝叶或树皮中直接提取。紫杉醇的不稳定，分离周期长，易受酸碱、温度等条件的影响发生异构和降解，同时，分离效率低导致生产成本较高，又使有限的红豆杉的资源难以达到有效的利用。因此，对紫杉醇的提取和纯化技术进行更深入全面的探究，建立快速、高效、经济、环保的提取和分离纯化方法显得十分必要和紧迫。笔者在此综述了紫杉醇的提取和分离纯化技术。

1 紫杉醇的提取方法

1.1 溶剂萃取法

溶剂萃取常用于紫杉醇粗提阶段，粗提阶段一般包括初级萃取和次级萃取。对于从植物体和细胞培养物中初步提取紫杉醇，主要采用溶剂萃取法。Mcpartland等通过液液萃取法对细胞培养物中的紫杉醇进行了分离纯化，以及对不同的溶剂和紫杉醇的结构进行了较全面的研究[3]。初级萃取和次级萃取一般采用不同的溶剂系统。有研究表明，在甲醇、乙醇、己烷、异丙醇、乙醚、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-二氯甲烷、乙酸乙酯-丙酮、乙酸乙酯-乙醚等溶剂中，单一溶剂以甲醇提取效果最好，混合溶剂则以乙酸乙酯-丙酮（1∶1）提取的效果最好[4]。近年来，随着超声技术的引入，大大缩短了初级萃取过程的时间，萃取达到平衡的时间约为20～40 min[5]，而无超声振荡所需时间长达16～48 h[6]。在进行红豆杉属细胞培养紫杉醇的分离中，Lee等引入了另一种新技术——微波辅助萃取技术，大大缩短了时间，且收率高达95%[7]。

另外，超声和微波等技术可使试验在较低温下进行，避免紫杉醇在高温下降解或异构而降低了其回收率。

1.2 固相萃取法

由于红豆杉属植物体材料中成分复杂，紫杉醇含量极低，且有与紫杉醇结构极为相似的紫杉烷类物质，提取分离困难，而固相萃取法（SPE）可快速除去紫杉醇浸膏中的脂、蜡及色素等杂质，大大减轻了后续色谱分离负担。Li等利用中性氧化铝萃取，并结合大孔吸附树脂为固定相的第二色谱法进行紫杉醇的分离纯化，回收率达98.3%[8]。在萃取真菌发酵液的乙酸乙酯提取物过程中，庞欣等用苯基固相柱进行固相萃取，效果显著[9]。

固相萃取法是一种省时、省溶剂、萃取效率高以及选择性好的新型萃取方法，可简化操作过程，降低成本，因而倍受青睐。

1.3 超临界流体萃取法

超临界流体萃取（SFE）是近代化工分离中出现的高新技术。在紫杉醉的纯化过程中，该技术减少了含氯有机溶剂的使用，是一种比较环保的的新技术。超临界萃取最常用的溶剂是CO2，其具有类似气体的扩散系数、液体的溶解力，表面张力为零，能迅速渗透进固体物质之中，具有高效、不易氧化、纯天然、无化学污染等特点。

Qiao等利用CO2及乙醇的混合物为超临界流体萃取红豆杉枝叶，紫杉醇的回收率达89.57%，选择性也大大提高[5]。但该法对仪器设备要求较高，限制了其应用。

1.4 膜分离法

膜分离法是一种新型隔膜分离技术。Carver等研究了反渗透膜和超滤膜在紫杉烷类物质的分离过程中的应用，发现膜分离技术可使浸膏中紫杉烷类物质的浓度提高5倍左右，大大减少了后续色谱分离的负担[10]。张梅等利用0.5 μm微孔滤膜对提取浸膏进行过滤，紫杉醇杂质去除率达31.5%，回收率89.7%以上[11]。膜分离法可省去液液萃取步骤，节省了萃取溶剂。

1.5 树脂层析法

大孔树脂吸附分离技术是一种提取精制的新工艺，广泛用于纯化苷类、黄酮类、生物碱类成分。对紫杉醇结构的研究表明，其分子上的多环结构易被带苯环的吸附剂吸附，这为大分子树脂应用于分离纯化紫杉醇提供了可能。Chen等研究发现D101和WLD3混合树脂对紫杉醇有很好的分离效果，回收率达93%[12]。

李勇超等采用D4020型大孔树脂对红豆杉产紫杉醇内生真菌发酵液的粗提液进行吸附和洗脱试验，结果表明D4020型吸附树脂对紫杉醇吸附分离效果显著，回收率达90%[13]。

树脂层析法分离纯化紫杉醇具有其独特的优点，若能根据紫杉醇的物化性质研制出比较专一的分离紫杉醇的新型树脂，那么树脂层析法将会得到更为广泛的应用。

1.6 柱切换技术法

柱切换技术是近10年里应用越来越广泛的一种色谱分析技术，主要用于复杂样品的分析，有效简化样品处理过程，缩短了分析时间，达到样品在线净化和组分富集的目的。液相色谱柱切换法是一种在线的固相分离技术，常用一个长3～5 cm、填料粒径 25～40 μm的预处理柱，选择一个低溶剂强度的流动相使样品净化、富集；启动切换阀，组分进入分析柱分离测定。该法可以获得高纯度的样品，在紫杉醇的提取分离中有广泛应用。

2 紫杉醇的分离纯化

2.1 柱色谱法

柱色谱法是目前分离纯化紫杉醇最普遍采用的方法，分为正相色谱和反相色谱，根据吸附剂的不同，常见的正相柱有硅胶、氧化铝等，反相柱有C18、苯基柱等，还包括其他一些特制的吸附剂。

雒丽娜等在反相色谱中使用了一种新型的自制多孔高分子树脂填料（PRP6）作为固定相，结果表明，PRP6对紫杉醇和三尖杉宁碱（cephalomannine）具有高的选择性，不可逆吸附小，且填料可回收再利用[14]。Pyo等HPLC采用二氧化硅和十八烷基硅胶（ODS）为固定相，以1.5%～1.8%甲醇的二氯甲烷洗脱，结果发现紫杉醇的回收率达90%以上，纯度达99.5%以上[15]。李长明等将2根层析柱用管道串联且2根层析柱之间设置用于控制分流的三通阀的，在2根层析柱中装入不同的固定相，从而实现在一个层析系统中使用2种固定相，增加了固定相和目标产物之间的选择性，并通过将三元流动相和二元固定相在一个层析系统中进行巧妙组合，提高了分离效率，降低了生产成本[16]。Li等采用中压硅胶柱分离紫杉醇，以二氯甲烷∶乙腈（7∶3）的体积比为流动相对紫杉醇进行了纯化，经过一次柱层析紫杉醇的回收率就达75%以上，结晶后纯度达99%[17]。

2.2 其他色谱法

随着现代科学技术的发展，除了高效液相色谱（HPLC）外，陆续有新的色谱技术在紫杉醇的分离纯化中被引用，常见的有薄层色谱（TLC）、高效置换色谱法（HPDC）、高效逆流色谱（HSCCC）、胶束电动色谱（MEKC）等。

Gangadevi等为了测定由药用植物内生真菌产生的紫杉醇，建立了紫杉醇检测的薄层层析（TLC）方法，结果表明，应用薄层层析技术对真菌的发酵产物进行检测比HPLC方法更加高效，能够简便、准确地筛选到紫杉醇产生菌株，且可以初步推测菌株的紫杉醇产生能力[18]。

HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。Watchueng等首先运用甲醇-水-三氟乙酸（10.0∶89.9∶0.1，V/V/V）萃取，所提取的紫杉醇被吸附在C18AQ（50 mm×20 mm，20 μm）捕集柱上，然后将4.6 mm内径的C18柱连接到这种C18柱上，使用等浓度的乙腈-水-三氟乙酸（30.0∶69.9∶0.1，V/V/V）的流动相组成的十六烷基吡啶鎓三氟乙酸盐（3 mg/ml）的置换剂对紫杉醇进行洗脱，且自然结晶，最终结晶到114 mg的紫杉醇，回收率达90%，纯度达99.4%[19]。

HSCCC技术是20世纪80年代美国国立卫生研究院发明的一种基于动态液-液分配机理新型色谱分离纯化技术。HSCCC技术具有制备量大、回收率高、消耗溶剂少的优点，同时在操作上所表现出的灵活性和多功能性是其他色谱所不能比拟的。尽管HSCCC技术有许多理论和技术问题需要进一步研究解决，但因其具有其他色谱所不能比拟的优点优势，并随着相关的理论和技术的不断完善，HSCCC技术势必会在天然药物分离、分析领域以及生产领域的应用发挥越来越大的作用。

Chan等利用胶束电动色谱（MEKC）体系来分离紫杉醇以及紫杉烷类化合物（三尖杉宁碱、巴卡亭Ⅲ以及它们的去乙酰衍生物），采用 Beckman P/ACE毛细管电泳系统，使纳克级的样品用几微升的溶剂在 15 s内完成了分离，大大地减少溶剂的浪费[20]。

2.3 化学反应法

化学反应法是通过化学的方法将2种或2种以上的物质分开，在紫杉醇中的应用就是通过化学的方法将紫杉醇与紫杉醇结构相似的三尖杉宁碱（cephalomannine）分离，通过化学反应将三尖杉宁碱转化为易与紫杉醇分离的物质，然后再经过相应的分离技术加以分离。因紫杉醇和三尖杉宁碱（cephalomannine）这2种物质的结构中只有C-13侧链末端不同，导致了它们的结构非常相似，因此两者的色谱行为也很相似，用常规的色谱技术很难将二者完全分开。

李隆等将紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物溶于甲醇中，加入有机碱类催化剂1，8-二氮杂二环-双环（5，4，0）-7- 十一烯，结果发现三尖杉宁碱能与这种催化剂发生1，4-加成反应生成3”- 烷氧基三尖杉宁碱衍生物，而与其结构相似的紫杉醇却没有发生任何反应，最终的混合物经胶柱层析就可以将紫杉醇和三尖杉宁碱（cephalomannine）分开[21]。郑玲等对三尖杉宁碱进行溴代反应，使cephalomannine 转化为2，3dibromocephalomannine，而紫杉醇不受影响，结果表明溴代反应后2，3dibromocephalomannine与紫杉醇的比移值大大分开，有利于紫杉醇的分离纯化，经硅胶柱分离纯化，紫杉醇的纯度达95%以上[22]。

2.4 药理药靶法

药理作用靶点法是根据药物药理作用原理提出的一种药物分离纯化的新型技术方法，是以药理作用靶点作为分离介质，使抗癌药物与靶点特异性的、可逆的相互作用而进行抗癌药物的分离纯化。有研究表明紫杉醇的作用靶点是体内的微管（微管蛋白的聚合态），微管蛋白具有高温下聚合低温下解聚的特点；紫杉醇可与微管特异性的结合并能抑制微管的解聚，而不与解聚状态下的微管二聚体发生作用，与紫杉醇结构性质相似的三尖杉宁碱（cephalomannine）则不具有这种特性，进而达到了紫杉醇和三尖杉宁碱较好的分离[23]。

作为一种新型的分离纯化技术，药理药靶法具有简便、高效特异性的特点；紫杉醇在天然抗癌药物方面以及紫杉醇药理作用靶点微管在药理作用靶点方面均具有代表性，其研究成果易于推广到其他抗癌物质及其药理作用靶点的物系，具有普遍应用价值。

2.5 细胞生物学方法

紫杉醇作为一种抗癌药物，其抗癌机理是在一定条件下诱导微管蛋白聚合并抑制其解聚，从而抑制细胞分裂。根据这一特性，利用紫杉醇依赖性细胞系的这种可逆性的、特异性的相互作用，紫杉醇及其紫杉烷类化合物达到了分离纯化的目的。但因该方法缺少专一性，限制其生产中的应用。

3 结论

从红豆杉属植物中提取紫杉醇的方法已相当成熟，但因其在红豆杉中的含量很低，随着紫杉醇在市场上的需求增加，仅依靠从红豆杉属植物中提取紫杉醇是根本无法满足日益增长的市场需求。红豆杉属植物不是优势树种，红豆杉的大量砍伐不仅会导致红豆杉资源的枯竭，还会造成环境的破坏，带来严重的环保问题。随着新方法、新技术在紫杉醇生产工艺中的不断引入，加上提取分离技术的不断更新。这些技术方法必将促进紫杉醇的高效、环保、经济的产业化进程，改变目前紫杉醇在市场上供不应求局面，并促进医药卫生行业的发展及人类健康事业的较大进步。

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