秸秆沼气发酵预处理微生物菌剂的筛选与特征研究

张瑞等3334

摘要

[目的] 研究添加微生物菌剂对秸秆沼气发酵产气效果的影响。[方法] 从沼气发酵液、树木土壤和堆肥中分离出多种微生物。通过初筛、复筛、拮抗试验等方法保留其中10种进行菌株配伍，选择产酶最高的4种微生物组合研制微生物菌剂。[结果] 4种产酶最高的微生物组合中12号纤维素酶活最高，为11.398 U/ml；8号漆酶酶活最高，为0.083 U/ml。6号微生物菌剂与秸秆的投料质量比为1∶50时，产气量最高。[结论] 该研究制备的复合微生物菌剂，作为秸秆沼气发酵预处理菌剂具有良好的应用前景。

关键词 秸秆；微生物菌剂；沼气发酵

中图分类号 S181.3；X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03334-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of agents for pretreatment of biogas fermentation by adding microbial agents.

[Method] A variety of microorganisms were isolated from methane fermentation broth， trees and compost in the soil. Ten kinds of them were retained through screening， rescreening and antagonistic experiments. Four kinds of microorganisms with highest enzyme activity were retained for the development of microbial agents.

[Result] The results showed that No.12 and No.8 groups of microorganisms owned the highest cellulase activity and laccase activity of 11.398 U/ml and 0.083 U/ml， respectively. Among all combinations， the gas production of No.6 was highest with No.6 agents and straw feed ratio of 1∶50.

[Conclusion] The compound microbial agents prepared in this study had excellent application prospects as biogas fermentation agents with straws.

Key words Straw； Microbial agents； Biogas fermentation

我国每年可产生农作物秸秆约7亿t[1]，其最主要的利用方式为直接燃烧，这样既造成了资源的浪费，又对生态环境造成了严重的破坏。研究表明，以秸秆为原料发酵产气潜力非常巨大[2-3]，能源回收率可达52.18%[4]。2010年，我国沼气产量超过了130亿m3，生物气使用者达到了1.5亿人[5]。秸秆类物质因含有大量的纤维素、木质素、半纤维素等而不易降解[6]，若将秸秆直接入池发酵，秸秆表面的蜡质层未被破坏而易漂浮结壳，导致产气不佳。故在秸秆入池之前需对其进行预处理[7-9]。经过发酵剂的腐解， 原料中大分子有机物质充分分解为小分子糖类和酸类物质， 从而促进发酵， 使产气量增加[10]。

与物理法、化学法相比，微生物预处理具有条件温和、成本低和不存在环境污染等特点。近年来科研工作者采用紫外、DES、硫酸二乙酯、60Co-射线诱变等单一或复合诱变方法，不断筛选出高效降解纤维素的菌株[11-14]。同时，降解木质素的研究也有了一定的进展。如刘庆玉等分离筛选出1 株木质素降解菌X3，其35 d对木质素的降解率达43.31%[15]；陈敏等利用紫外诱变选育及高效筛选技术，从活性污泥中选育出高效降解黑液中木质素的优势混合菌和单一菌等[16]。然而，木质纤维素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果[17]。有不少研究尝试使用复合菌来处理木质纤维素[18-19]，以期达到快速降解的目的。鉴于此，笔者从沼气发酵液、树木土壤和堆肥中分离出多种好氧及厌氧微生物，并筛选出其中对木质素降解效果较好的菌种进行配伍，制备成专性的微生物预处理菌剂，以期对秸秆沼气发酵的效果起到更好的促进作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

微生物来源：实验室储备的猪粪加秸秆厌氧沼气发酵罐的沼液、堆肥、树木土壤。秸秆：连云港某农田。猪粪：南京浦口区某养猪场。

1.2 培养基

[20]

培养基Ⅰ：K2HPO4，0.225 g；MgSO4，0.090 g；KH2PO4，0.225 g；CaCl2·2H2O，0.030 g；（NH4）2SO4，0.225 g；酵母膏， 0.100 g；NaCl，0.450 g；秸秆粉，20 g；L-半胱氨酸，0.5 g， 蒸馏水，1 000 ml。用于从沼液中分离各种微生物。培养基Ⅱ：牛肉膏蛋白胨培养基，用于分离细菌。培养基Ⅲ：高氏1号培养基，用于分离放线菌。培养基Ⅳ：査氏培养基，用于分离霉菌。培养基Ⅴ：马铃薯培养基，用于分离真菌。

1.3 试验方法

1.3.1

菌种的分离。利用培养基Ⅰ，通过稀释平板法，从沼气发酵液中分离出好氧及兼型厌氧两种条件下的多种微生物，为第一部分微生物。

好氧方法为：用保鲜膜将平板包裹，倒置，放入30 ℃恒温培养箱中进行培养；兼型厌氧方法为：用保鲜膜将平板包裹，倒置，放在真空干燥器中。然后将真空干燥器抽真空，再充满N2，最后放入30 ℃恒温培养箱中进行培养。

利用培养基Ⅱ-Ⅴ，通过稀释平板法分别从树木土壤和堆肥中分离出多种微生物，为第二部分微生物。

1.3.2

菌种的初筛。对于第一部分微生物，利用液态培养基Ⅰ，分别进行富集培养，置于30 ℃恒温培养箱内培养5～7 d。再向其中分别加入相同质量的秸秆，充分混合，微生物在秸秆表面生长，对其进行降解。8～10 d以后，对秸秆中的木质素、纤维素、半纤维素的前后含量变化进行测定。从而筛选出降解效果好的优势菌种。

对于第二部分微生物，用各自的液态培养基进行富集培养，在30 ℃恒温培养箱中培养5～7 d。取100 ml菌液于烘干至恒重的滤纸上过滤，烘干。二者差值即为单位体积菌液中含微生物的质量。筛选出其中质量较大的微生物。

1.3.3

菌种的复筛。对“1.3.1”中筛选出来的微生物进行液态培养基Ⅰ发酵培养，5～6 d后，取适量的菌液。将菌液置于离心机中进行离心，2 500 r/min 10 min后，取上清液。

用两种方法测定菌液的酶活，即纤维素酶活[21]和漆酶酶活[22]。根据酶活大小，选择优势菌种。

1.3.4

菌种拮抗试验。将“1.3.3”中选出的优势菌种进行两两拮抗试验。根据拮抗试验中微生物的生长情况，舍弃最不易与其他微生物共生的菌株。

1.3.5

复合微生物菌剂的制备。

1.3.5.1

菌种配伍试验。对“1.3.4”中筛选出的微生物进行配伍。

将每一组组合的微生物混合，在液态富集培养基Ⅰ上培养，培养3～5 d，测定每一组的纤维素酶活和漆酶酶活。

比较两种酶活的大小，选择较高的4组配伍，进行下一步试验。

1.3.5.2

菌剂的制备。

将筛选出来的4种微生物配伍分别接种到加富培养基中进行发酵培养，获得高浓度微生物菌液，将菌液过滤，用蒸馏水反复洗涤3次，60 ℃低温真空干燥，获得微生物菌剂。

1.3.5.3

菌剂预处理秸秆沼气发酵。 取4组干粉菌剂0.15 g，分别加入10 ml含100 mg葡萄糖的溶液中进行糖化1 d，过滤，与15 g秸秆混合，37 ℃条件下预处理5～7 d。然后，将秸秆捞出，与猪粪按干质量1∶5，即15 g∶75 g混合，进行沼气发酵，中温37 ℃发酵30 d，并记录每日产气量，与不进行预处理的秸秆进行对比，选出产气量最高的一组菌种。试验装置如图1所示。

1.3.5.4

菌剂用量最优化试验。对筛选出的优势菌剂，按不同比例与秸秆混合，进行预处理，放入37 ℃恒温培养箱中，厌氧发酵产沼气。通过沼气量的大小，最终确定菌剂与秸秆的最佳投料比。

干粉菌剂与秸秆的质量比分别取1号1∶1 000、2号1∶500、3号1∶100、4号1∶50和5号1∶20，其中秸秆统一添加15 g。

3 结论

该研究系统地从沼气发酵液、树木土壤和堆肥中分离出多种微生物。通过初筛从中选出了16种优势菌种，再通过测定纤维素酶活与漆酶酶活的大小，从这16种微生物中选取了12种优势菌株，进行拮抗试验和菌株配伍，确定了4组产酶较高的微生物组合，并制成了对应的菌剂。最后，利用这4种菌剂对秸秆进行预处理，并投入沼气罐中，在37 ℃条件下进行厌氧发酵，根据30 d产气量，确定了6号菌剂为最优菌剂。最后，改变6号菌剂与秸秆的投料比，结果表明二者质量比为1∶50时，产气量最高。试验制备的复合微生物菌剂，作为秸秆沼气发酵预处理菌剂具有良好的应用前景。

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