碳源和氮源对人工栽培花脸香蘑菌丝生长及多糖含量的影响

伦志明 池玉杰

摘要 [目的]研究碳源和氮源对人工栽培花脸香蘑（Lepista sordida）菌丝生长和多糖产量的影响。[方法]以人工栽培花脸香蘑菌株为研究对象，利用液体培养的方法，通过比较分析菌丝体麦角固醇含量和多糖产量，研究不同碳源和氮源的影响。[结果]通过比较分析麦角固醇含量结果显示，果糖、甘露糖、纤维二糖、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖都可以作为花脸香蘑菌丝体生长的碳源，但相比之下，前三者生长效果更好，选择果糖作为碳源，多糖产量最高；丙氨酸、甘氨酸、黄豆粉和蛋白胨都可以作为氮源使用，其中以丙氨酸为氮源生长效果最好，以黄豆粉为氮源的多糖产量最高。[结论]该研究可为花脸香蘑菌丝体的研究与开发利用提供理论依据。

关键词 花脸香蘑；人工栽培；碳源；氮源

中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03195-04

Abstract [Objective] The aim is to study the effect of carbon and nitrogen sources on the growth and polysaccharide outputs of artificial Lepista sordida mycelia. [Method] The strain of artificial L. sordida was investigated for carbon and nitrogen nutrition by ergosterol contents and the production of polysaccharide in liquid media. [Result] The result shows that fructose， mannose， cellobiose， sucrose， glucose and maltose can be used as a carbon source for L. sordida strain by analyzing ergosterol contents. And the former three carbon materials are better for mycelia growth in contrast with sucrose， glucose and maltose. In the meantime， we can get the highest polysaccharide yield with fructose as a carbon source. Alanine， glycine， soybean powder and peptone can be used as a nitrogen source. Alanine is best for mycelia growth and bean powder can produce the highest polysaccharide. [Conclusion] The result provides theoretical basis for the study and production of L. sordida mycelia.

Key words Lepista sordida； Artificial cultivation； Carbon sources； Nitrogen sources

花脸香蘑（Lepista sordida）是一种草腐菌，也叫紫晶香蘑、丁香蘑、花脸蘑，属真菌界（Fungi）担子菌门（Basidiomycomycota）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑属（Lepista）[1]，广泛分布于河南、辽宁、江苏、黑龙江、北京、吉林、四川、甘肃、云南、江西、广东、青海、新疆、内蒙古、中国台湾和中国香港等地[2]，夏秋季生于富含腐殖质的山坡草地、农田、堆肥、草原及人工栽植的草坪等处，常常形成蘑菇圈。花脸香蘑具有较高的营养价值和药用价值，菌丝体和子实体中蛋白质含量都很高，含有18种氨基酸，其中8种人体所必需氨基酸含量丰富[3-5]，而脂肪含量却较低[6]，还含有丰富的钾、钙、镁及人体抗自由基、抗衰老、抗癌的硒、锗和锌等元素[7]，且菌丝发酵物具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗菌等活性[8-10]，因此，近年来吸引了越来越多的科研人员的关注。花脸香蘑香味浓郁、味道鲜美、颜色靓丽，在民间也颇爱百姓喜爱，然而，由于缺乏成熟的人工栽培技术而无法进行大规模商业化栽培，所以，目前市场销售上仍依赖于野生资源，也由此导致价格居高不下。在野生花脸香蘑产量较大的黑龙江省齐齐哈尔双河农场，鲜品价格为26～30元/kg，而干品更是高达600元/kg，即便如此，产品依然供不应求。相比于野生花脸香蘑高昂的售价和人工栽培技术的不成熟，花脸香蘑菌丝体却有着菌种容易分离、菌丝生长速度较快（试管菌种培养生长速度接近平菇）、没有污染的优势。因此，通过液体发酵培养菌丝体，进行花脸香蘑生理活性及功能性食品与药品的开发研究，不失为一条更加快捷有效的途径。为此，笔者利用人工栽培得到的花脸香蘑子实体，分离得到菌种，对其进行碳源、氮源试验，通过比较分析不同培养基中菌丝体生长量及菌丝体多糖产量，研究碳源和氮源所产生的不同影响，以期为花脸香蘑菌丝体研究与开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。 花脸香蘑菌株，分离自黑龙江农业经济职业学院食用菌研究所人工栽培获得的子实体。

1.1.2 主要仪器。DKS26恒温水浴锅，上海森信试验仪器有限公司生产；Cary50紫外分光光度计，美国VARIAN公司生产；KUBOTA6900高速冷冻落地式离心机，日本久保田株式会社生产；真空冷冻干燥机LGJ30，北京松源华兴科技发展有限公司生产；FW100高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司生产；HANPING FA2004电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司生产；SPX150C培养箱，上海博迅实业有限公司生产；Waters e26952998（二级阵列管检测器）高效液相色谱仪，美国Waters公司生产。

1.1.3 主要试剂。葡萄糖、果糖、甘露糖、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、蛋白胨、甘氨酸、丙氨酸、酒石酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、浓硫酸、无水乙醇、重蒸酚及琼脂粉等试剂均为国产分析纯，市售；麦角固醇标准样品（纯度99%），购自Sigma；甲醇（色谱纯）购自美国Fisher公司；黄豆粉购自本地市场。

1.2 方法

1.2.1 菌种培养。制作PDA培养基，9 cm培养皿中量入15 ml，将存放于4 ℃冰箱中的花脸香蘑试管菌种置于室温下活化24 h后，接入平板内，25 ℃、黑暗条件下静止培养，待菌丝长满后备用。

1.2.2 不同碳源液体培养基配制。基础培养基配方：葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH 6。分别以葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、纤维二糖作为碳源，以不含糖的基础培养基为对照，配制7种液体培养基，250 ml锥形瓶中分装25 ml，121 ℃灭菌20 min，每种培养基设置4个重复，冷却备用。

1.2.3 不同氮源液体培养基配制。基础培养基配方同“1.2.2”，分别以甘氨酸、丙氨酸、酒石酸铵、尿素、黄豆粉、蛋白胨为氮源，以不含氮的基础培养基为对照，配制7种液体培养基，250 ml锥形瓶中分装25 ml，每种培养基设置4个重复，121 ℃灭菌20 min，冷却备用。

1.2.4 菌丝体的培养。用打孔器从平板培养的花脸香蘑菌落边缘打下5个直径为8 mm的圆形菌块，接入装有各种液体培养基的锥形瓶中，25 ℃、黑暗条件下静止培养。

1.2.5 菌丝体麦角固醇含量的测定。麦角固醇是真菌细胞膜的组分之一，广泛存在于真菌而罕见于高等植物中[11]，其含量与真菌生物量之间有着直接的关系[12]。在试验研究中，总是需要对于天然基质中的真菌生物量进行精确测定，然而，这种测定由于其与基质不可能进行物理分离而变得十分困难[13]。麦角固醇在紫外线λmax=282 nm处有吸收值[14]，可以用无水乙醇（4 ℃）提取并用高效液相色谱法（HPLC）进行定量分析[15]。因此，麦角固醇含量被广泛应用于谷物、土壤、菌根、饲料、马铃薯产品、菜子油、泥沙、天然湿地、植物和室内环境真菌生物量的测定方面[16]。该试验中，通过分析检测菌丝体中麦角固醇含量对花脸香蘑菌丝体生物量进行比较分析。

1.2.5.1 麦角固醇标准溶液的配制。电子天平称取麦角固醇标准样品6.5 mg，加入4 ℃无水冷乙醇6.5 ml，使之溶解，配制成浓度为1.0 mg/ml的标准溶液。

1.2.5.2 线性关系的考察。移液器量取1.0 mg/ml的标准溶液2 ml，加入10 ml离心管中，用2 ml无水乙醇稀释，制成浓度0.5 mg/ml的标准溶液，依此方法，用4 ℃无水乙醇逐级稀释，分别配制成浓度为0.100、0.050、0.010、0.005和0.001 mg/ml的标准溶液，以4 ℃无水乙醇为对照，HPLC测定吸收值。检测条件设定为：MSC18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），波长282 nm，柱温25 ℃，流速1 ml/min，注样量20 μl，纯甲醇流动相，运行时间15 min，检测吸收峰的出现，以标准样品浓度（Y，μg/ml）为纵坐标，峰面积（X）为横坐标，绘制麦角固醇标准吸收曲线，计算线性回归方程。

1.2.5.3 菌丝体麦角固醇的提取与含量测定。菌丝体培养15 d后，用尼龙膜过滤（孔径24×30 μm），再用蒸馏水洗涤2次，收集于10 ml离心管中，冷冻干燥24 h；将冷冻干燥后的菌丝体移入研钵，加入4 ℃无水冷乙醇3 ml，研磨菌丝体成为均匀的糊状；将糊状液移入1个10 ml离心管中，再用0.5 ml无水冷乙醇洗濯研钵，洗涤物一并装入离心管中，12 000 r/min离心5 min；将上清液移出，沉淀物加入1.0 ml无水冷乙醇（4 ℃），悬振40 s，12 000 r/min离心5 min，合并上清液，按上述方法用HPLC在282 nm处检测吸收峰，按下式计算麦角固醇含量：麦角固醇含量（μg/培养容器）=C×V，式中，C为按照回归方程计算得到的麦角固醇浓度（μg/ml），V为无水乙醇提取液容积（ml）。2.3 氮源对菌丝体生长的影响

从菌丝生长情况看，不含氮源的液体培养基（对照）与酒石酸铵培养基中菌丝生长情况一般；含蛋白胨培养基中，菌丝生长较好；添加黄豆粉、甘氨酸、丙氨酸的培养基中，菌丝生长良好，在黄豆粉培养基中，菌丝呈现明显的紫色，且有很浓的蘑菇气味，此种现象在其他碳源和氮源培养基中都未出现；添加尿素的培养基中，观察不到菌丝生长的现象。

从图5可以看出，在丙氨酸作为氮源的培养基中生长的菌丝，麦角固醇含量最高，且统计分析结果显示，与其他各培养基相比，存在显著性差异；其次为甘氨酸，再次为黄豆粉，二者差异不显著；以蛋白胨作氮源，菌丝体生物量不及前三者，但好于酒石酸铵；对照中不含有氮源，但有葡萄糖，所以菌丝也有生长，与酒石酸铵生长量没有显著差异；尿素培养基中，菌丝生物量最低，甚至远低于对照，这可能是由于培养基配制过程中，经过高压灭菌，尿素产生了有害物质，而且是液体培养，直接与菌丝接触，使某些菌丝中毒死亡，才导致这种结果的出现。所以，从菌丝体生物量数据比较结果上看，丙氨酸、甘氨酸、黄豆粉和蛋白胨都可以作为氮源使用，其中丙氨酸生长效果最好，而尿素则不适于用作液体培养中的氮源。

2.4 碳源对菌丝体多糖含量的影响

从图6可以看出，各种碳源培养基中生长的菌丝体多糖含量都高于对照，统计分析结果表明差异显著；多糖含量最高的是含果糖培养基，与其他各培养基之间存在显著性差异；其次为含麦芽糖培养基，再次为含纤维二糖培养基，但二者之间差异不显著；含甘露糖与蔗糖培养基多糖产量低于含纤维二糖培养基，但三者之间没有显著性差异；各种碳源培养基相比较，添加葡萄糖的培养基菌丝体多糖产量最低，然而，从统计分析结果上看，与含甘露糖和蔗糖培养基差异却不显著。所以，该试验条件下，选择果糖作为碳源进行菌丝体液体培养，多糖产量最高。

3 结论

该研究以人工栽培的花脸香蘑分离获得的菌株为研究对象，采用液体培养的方法，对菌丝体进行碳源和氮源利用能力试验，通过比较分析菌丝体麦角固醇含量和多糖含量，研究不同碳源和氮源对菌丝体生长和多糖含量的影响。通过比较分析麦角固醇含量结果显示，果糖、甘露糖、纤维二糖、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖都可以作为花脸香蘑菌丝体生长的碳源，但相比之下，果糖、甘露糖和纤维二糖是更为理想的碳源，而选择果糖作为碳源，多糖含量则最高。丙氨酸、甘氨酸、黄豆粉和蛋白胨都可以作为氮源使用，添加丙氨酸的培养基中，菌丝生长效果最好，而含有黄豆粉的培养基中，则是多糖含量最高。不论是比较菌丝体生物量，还是分析多糖含量，其结果都显示，在液体培养条件下，不应该选择尿素作为氮源。

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