碳源对固定化费氏丙酸菌生产丙酸的影响研究

揣玉多等

摘要 [目的]研究碳源对固定化费氏丙酸菌生产丙酸的影响。[方法]采用吸附-包埋结合法制备固定化费氏丙酸菌细胞，用于生产丙酸，研究了碳源（葡萄糖、乳酸钠和蔗糖）及其浓度对固定化细胞生产丙酸的影响。[结果]最适宜的碳源为乳酸钠，最适浓度为40 g/L，丙酸产量13.03 g/L。[结论]试验考察了碳源对固定化费氏丙酸菌生产丙酸的影响，为费氏丙酸菌的开发利用提供了依据。

关键词 费氏丙酸菌；丙酸；碳源

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03191-02

Abstract [Objective] To study effects of carbon sources on propionic acid production by immobilized Propionibacterium freudenreichii. [Method] The cells of Propionibacterium freudenreichii were immobilized in adsorptionentrapping methods for the production of propionic acid. The effect of the carbon sources （glucose， sodium lactate， sucrose） and their concentration on propionic acid production were investigated. [Result] The experimental results showed that the sodium lactate was more suitable carbon source than glucose and sucrose. The yield of propionic acid fermented with immobilized Propionibacterium freudenreichii reached up to13.03 g/L with The optimal sodium lactate concentration of 40 g/L. [Conclusion] Effects of carbon sources on propionic acid production by immobilized Propionibacterium freudenreichii were investigated， which will provide reference for development and utilization of Propionibacterium freudenreichii.

Key words Propionibacterium freudenreichii； Propionic acid； Carbon sources

近10年来，我国丙酸的需求量猛增。在饲料加工，谷物防霉，食品防腐和农药医药方面均有巨大的潜在市场，因此我国丙酸行业的开发将有广阔的前景[1-2]。目前，丙酸的工业化生产方法为化学合成法[3]，但是随着全球环境保护意识和能源节约意识的增强，以及一些欧盟国家担忧化学合成法生产的丙酸可能存在食品安全问题，近年来，越来越多人围绕微生物发酵法生产丙酸进行了大量的研究工作[4-5]。笔者采用吸附-包埋结合法制备的固定化费氏丙酸菌细胞用于发酵生产丙酸，在对菌种选育和固定化方法研究的基础上，参考陈玉梅[6]、Himmi EH[7]、Coral J[8]、Leaver FW[9]、Wang Z[10]等试验结果，选取葡萄糖、乳酸钠和蔗糖3种常用的单一碳源进行固定化费氏丙酸菌细胞发酵生产丙酸的试验研究，以期为费氏丙酸菌的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种。费氏丙酸杆菌（P.freudeneichii）的突变株Pf 007，由天津科技大学工业微生物教育部重点实验室保存。

1.1.2 培养基。活化培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸铵5 g/L，pH=7.2；发酵培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸铵5 g/L，碳酸钙3 g/L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 固定化菌体的制备。①菌悬液的制备。取丙酸菌发酵液200 ml放入离心杯中，于18 000 r/min离心10 min，去除清液，再加入生理盐水摇匀，然后离心洗涤两次。加入60 ml无菌水摇匀制成菌悬液。②包埋剂的制备。按3%∶3%的比例称取一定量的聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（CA），加入15 ml去离子水加热融化，搅拌至充分混合，封口，放置到灭菌锅，于115 ℃下灭菌20 min。③交联剂的制备。配成3%的氯化钙溶液即为交联剂。④固定化凝胶小球的成型。按5 ml菌悬液加入0.600 g麸皮的比例，向菌悬液中加入麸皮，混匀，然后将配好的包埋剂倒入上述混合液中，混匀，利用注射器吸取并滴入交联剂中。⑤交联。完成上述工作后，将该小球交联24 h以保证其强度。交联24 h后，用生理盐水冲洗。然后转到生理盐水中，放到4 ℃冰箱保存。

1.2.2 不同碳源发酵生产丙酸的方法。分别以20、40、60和80 g/L的葡萄糖、乳酸钠和蔗糖为底物，经过72 h的发酵，测丙酸产量，计算丙酸转化率。计算公式为：丙酸转化率（%）=丙酸产量/碳源浓度×100。

1.2.3 发酵条件。3%接种量，装液量为250 ml磨口三角瓶装液100 ml，发酵温度30 ℃，静置培养72 h。

1.2.4 丙酸菌代谢产物丙酸的分析方法[11]。

1.2.5 葡萄糖、乳酸和蔗糖的分析测定。使用SBA40生物传感分析仪对发酵液中的葡萄糖、乳酸和蔗糖进行测定。取发酵液1 ml，10 000 r/min离心5 min，然后稀释10倍，用微量注射器取上清液25 μl进样。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的葡萄糖对丙酸菌发酵的影响 图1表明，发酵8 h，丙酸的产生速度较快，丙酸产生速度分别为0.98、0.78、0.53和0.54 g/L·h。随着时间的增加，较低的葡萄糖浓度产酸速度比高浓度的要快一些，逐渐趋于平缓，这是因为酸的产生抑制了丙酸菌的发酵[12]，同时可以看出葡萄糖（底物）浓度越高，对丙酸菌的抑制作用越强，底物的利用率越低。葡萄糖浓度为40 g/L时，丙酸产量为11.54 g/L，丙酸转化率29%，是比较适合的底物浓度。

3 结论

试验采用吸附-包埋结合法制备的固定化费氏丙酸菌细胞用于发酵生产丙酸，在对菌种选育和固定化方法研究（方法另文发表）的基础上，参考陈玉梅[6]、Himmi EH[7]、Coral J[8]、Leaver FW[9]、Wang Z[10]等试验结果，选取葡萄糖、乳酸钠和蔗糖3种单一碳源进行固定化费氏丙酸菌细胞发酵生产丙酸的研究。结果表明，与葡萄糖、蔗糖相比，40 g/L乳酸钠的丙酸产量较高，达到13.03 g/L，底物利用率达到97%，丙酸转化率达到33%。最适宜的碳源为乳酸钠，最适浓度为40 g/L，丙酸产量13.03 g/L。因此确定以40 g/L乳酸钠为碳源进行固定化费氏丙酸菌发酵生产丙酸。

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