木薯细胞壁酸性转化酶玀eCWINCV5基因启动子的克隆和序列分析

夏文睿等

摘要 [目的]了解MeCWINCV5在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中的功能。[方法]采用PCR方法从木薯基因组中分离MeCWINCV5基因启动子序列，考察MeCWINCV5对植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答的影响。[结果]分析显示启动子的长度为1 170 bp，含有TATA box和CAAT box等多个典型的真核生物启动子基本元件元件，还存在大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件，如HSE、MBS、SARE、GAREmotif和TATC-box等多个与植物逆境胁迫相关的元件。[结论]MeCWINCV5基因启动子与逆境胁迫有关，在木薯抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要作用。

关键词 木薯；细胞壁酸性转化酶；启动子；逆境胁迫；顺式调控元件

中图分类号 S632 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03179-03

Abstract [Objective] In order to study the promoter MeCWINCV5 in cassava which play important roles in plant growth and development，hormone regulations and stress responses.[Method] An 1 170 bp promoter region upstream of the MeCWINCV5 gene was isolated from cassava genomic DNA using PCR methods.[Result] Sequence analysis found that it contains a typical TATA box and CAAT box，and several cisacting elements that relate plant stress responses，such as HSE，MBS，SARE，GAREmotif，TATCbox transcription factor.[Conclusion] It is suggested that MeCWINCV5 gene may play important roles in response to various stresses.

Key words Cassava； Cell wall acid invertase； Promoter； Stress responsiveness； Cisacting element

木薯是全球最重要的粮食作物之一，但是块根中积累的淀粉含量远远低于理论产量。蔗糖在淀粉积累过程中作为沟通源器官和库器官的桥梁，而在源叶中合成的蔗糖从叶（源）到块根（库）的长途运输过程主要由蔗糖转化酶（INV）来调控完成[1-3]。蔗糖转化酶根据其最适pH值分为中性转化酶 （neutral invertase，NI）和酸性转化酶 （acid invertase，AI）[4]。细胞壁酸性转化酶催化蔗糖的分解是韧皮部卸载的关键步骤[5]。在库器官中提高细胞壁酸性转化酶的活性有利于蔗糖在库器官中的积累，也是植物源库器官蔗糖代谢的关键酶[6]。研究者通过研究木薯细胞壁酸性转化酶基因启动子上的生长激素相关元件和逆境相关反应元件与启动子的相互作用来探讨木薯细胞壁酸性转化酶基因启动子对转化酶基因的调控作用[7]。笔者采用PCR方法从木薯基因组中分离MeCWINCV5基因启动子序列，考察MeCWINCV5对植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答的影响，以期为MeCWINCV5的合理开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 华南木薯8号，由实验室采购。

1.2 方法

1.2.1 华南木梳8号基因组DNA的提取（CTAB 法）[8]。取 1.000 g经暗培养 2～3 d的幼嫩木薯叶片（去叶脉），经液氮研磨后加入预热至65 ℃的CTAB提取缓冲液中提取，上清液加等体积氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）混匀后离心；上清液用等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V/V）和氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）反复抽提。加入1/10体积NaAc（3 mol/L，pH5.2）和2倍体积冷乙醇以沉淀 DNA（2 h），分别用70%、80%乙醇洗涤沉淀并加入100 μl TE缓冲液回溶DNA沉淀，同时加入2 μl RNase，置37 ℃处理2 h。再用等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V/V）和氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）分别抽提，吸取上清液，重新沉淀DNA，用浓度70%乙醇，清洗风干，加入适量体积的去离子水回溶。

1.2.2 木薯细胞壁酸性转化酶MeCWINCV5基因启动子。根据课题组已经克隆得到的木薯细胞壁酸性转化酶基因MCWINV5序列（GeneBank：X291159）和phytozome植物基因序列预测库的木薯MCWINV5基因序列，设计引物如下，CW5F：5ATGAGCTCTAATGCAGTCCGAC

AC3和CW5R： 5GTGGATCCGATCGAAGAAAAAAG3，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，56 ℃退火延伸150 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 生物信息学分析。将测序得到的片段序列与MeCWINCV5基因的序列比对，确定扩增的启动子序列的正确性。利用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）和PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线软件分析启动子序列，预测顺式作用元件位点[9]。

2 结果与分析

2.1 启动子片段的扩增与克隆 根据已经克隆得到的木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV5（GeneBank：X291159）序列和phytozome植物基因序列预测库的木薯MeCWINV5基因序列设计引无为CW5F：5ATGAGCTCTAATGCAGTCCGACAC3和CW5R：5GTGGATCCGA TCGAAGAAAAAAG3，从华南8号木薯组培苗中扩增得到一段长为1 300 bp的序列，命名为cw5（图1）。将片段与pMD19T进行连接，通过菌液PCR，筛选获得阳性单克隆测序后，将其与MeCWINV5基因CDs区序列和phytozome植物基因序列预测库中相应序列进行比对，结果发现此片段含有MeCWINV2基因从ATG起始的长为130 bp的CDs序列和ATG上游长为1 170 bp的潜在启动子序列（图2）。

3 结论与讨论

试验采用PCR的方法对华南木薯8号MeCWINV5基因启动子进行了克隆，得到一段长为1 170 bp的启动子序列，对该片段序列进行分析，发现此片段上含有CAAT box和TATA box等多个典型的真核生物启动子元件，并且含有热胁迫响应的答元件HSE，干旱诱导相关元件MBS，水杨酸响应元件SARE，赤霉素反应元件GAREmotif、TATCbox和胁迫防御元件TCrich repeats等多个顺式作用元件。在拟南芥[10]，烟草[11]，大豆[12]等植物转化酶基因启动子已验证上述激素调控和胁迫，由此可以看出MeCWINV5可能参与多种信号传播，并且在木薯逆境胁迫应答中起到了重要作用。由于细胞壁转化酶MeCWINV5基因在植物生命活动中和逆境胁迫起到越来越重要的作用，而被人们所关注，近年来关于细胞壁转化酶基因的研究有了一定的进展，但是大部分停留在对启动子的克隆以及序列分析阶段，其作用机制依然空缺，启动子在基因上游部分，调控基因的表达，预测基因的功能，如果能进一步对启动子序列进行研究，就可以为研究基因功能和启动子作用元件分析提供方向和依据。

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