炎症小体在真菌感染中的作用机理研究进展

张丽萍　帕丽达·阿布力孜

作为宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线，天然免疫系统可以通过诱导吞噬作用和炎症反应等途径，快速识别和清除入侵的病原，而且在诱导和激活获得性免疫反应中天然免疫系统也发挥着重要作用。病原体相关分子模式（pathogen- associated molecular patterns，PAMP）是天然免疫通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR） 来识别病原体的保守结构。这些受体能够被相关的分子模型识别， 激活细胞中的一些位于下游信号通路，使机体能够应对病原体的入侵 [1-3] 。信号的识别和启动各种宿主防御的途径核蛋白因子kB（Nuclear factor kB，NF-KB）以及应力激酶的活化，干扰素响应因子（Interferon Response Factor，IRFs），半胱天冬酶等的参与来完成。除识别PAMPs外，上述这些受体同时可以识别一些由于细胞死亡和组织损伤等释放出来的内源性危险信号（danger associated molecular patterns，DAMPs）。由凋亡相关微粒蛋白（apoptosis- associated speck-like protein containing CARD，ASC）、caspase蛋白酶以及一种NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）家族蛋白（如NLRP1）或HIN200（hemopoietic IFN-inducible nuclear proteins 200-amino acid motif）族蛋白（如AIM2）等蛋白组成，并对感染细胞的病原微生物及其产物等快速识别的一种多蛋白复合体，称为炎症复合体[4]。由于NLPR3炎症复合体可以被多种病原微生物激活，参与机体的免疫应答，目前人们研究NLRP3的比较多。真菌感染后可造成机体的皮肤等组织损伤，特别是可造成脱发，使患者的外在形象受到影响，后期可能还需要借助美容等相关手段，使患者的皮肤及毛发等恢复患病前状态。本文就炎症小体在真菌感染免疫中的作用及研究进展综述如下。

1 NLR 家族和炎症小体

NLR 家族成员在结构上包含3个比较有特征的结构[5-7]，NACHT是其结构域中最为重要的部分，又称NOD结构域；C端是亮氨酸重复序列较多的结构（LRR）；其N端是效应结构域。根据N端结构域的不同，又可以将NLR家族分为4个亚家族。除此之外，还有一个能够调节炎症信号，定位于线粒体的分子NLRX1，此分子与任何一种亚组都没有明显的同源性。

炎症小体可使Caspase-1活化， 并促进IL-1β前体分子的成熟和释放。自Martinon等首次报道以来，到目前为止已发现IPAF、 NALP1 、NALP2 和NALP3共4种炎症复合体，其命名是根据其核心成分（NLRs）的不同。细菌感染后NLRP家族成员可触发炎症小体的募集，并在调节炎症小体的募集中起重要的作用，因为其可通过细菌分泌系统或细菌产生的毒素感受膜干扰信息或转运细菌成分进入胞质 [8] 。研究发现NLRP1炎症小体能够被炭疽毒素所激活[9]，IPAF 能够识别细菌的O型或O型分泌系统以及一些胞内菌的鞭毛蛋白[10] ，AIM-2 主要识别细菌和病毒的DNA[11]。目前NLRP3 炎症复合体是研究最多的一种炎症复合体，因为其可被各种类型的细菌、病毒和分子所激活。

2 NLRP3炎症小体

2.1 NLRP3炎症小体的活化信号机制：NLRP3炎症小体能够处于自身抑制状态，在NLRP3炎症小体被激活之前 [12]。SGT1 （suppressor of the G2 allele of skp1） 和热休克蛋白90 （heat shock protein 90kD，HSP90）被会被释放出来在NLRP3炎症小体接受刺激后，然后NLRP3通过NACHT结构域发生自身寡聚化，并通过PYD-PYD同源结构域的相互作用募集ASC，ASC通过CARD-CARD同源结构域的相互作用募集pro-caspase-1，最终形成能诱导pro-caspase-l自身剪切，形成活化型caspase-1的多蛋白复合体-NLRP3炎症小体[13]。众所周知 ，IL-1β在免疫炎症反应中发挥核心作用，在炎性致病机制中其起决定性作用。无活的 IL-1β前体必须经caspase-1剪切才能成为有活性的成熟的IL-1β分泌到细胞外[14-18]，介导炎症反应。

2.2 NLRP3炎症小体的激活模式：到目前为止，对于NLRP3 炎症小体的激活共提出3种模式：①半通道模式：钾离子外流，当钾离子达到一定浓度后，caspase-1的活化就会受到抑制，有研究证实能够通过Pannexin-1 在细胞膜形成小孔[19-20]，从而使微生物分子进入细胞内激活NLRP3炎症小体； ②溶酶体破坏模式：二氧化硅、硅石等这些晶体能够破坏溶酶体，被破坏掉的溶酶体释放出组织蛋白酶B，进一步激活NLRP3炎症小体，溶酶体被抑制后炎症小体也被抑制 [21-27]；③活性氧物质（ROS）模式：此模式是研究较成熟的一个模式，NLRP3炎症小体的激活过程不仅可以被ROS激活，也可以被ROS 的抑制剂或清除剂所抑制[28]。有研究发现NLRP3炎症小体最终的激活是通过氧化应激和硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的作用，硫氧还原蛋白充当氧化中的清道夫，在ROS增加时自身可以被氧化[29]。正常状态下，TXNIP与抗氧化还原酶、硫氧还蛋白（TRX）相连接，氧化应激后，TXNIP被硫氧还蛋白释放并激活NLRP3[30]。受外来刺激，线粒体呼吸链产生ROS，引起NLRP3炎症反应的激活，同时能清除损伤线粒体的自噬体，对线粒体ROS 的产生起负向调节的作用[31]。尽管NLRP3炎症小体激活的ROS 模式具有更好的解释性，但仍存在许多无法解释的问题。如TNF-A，可诱导ROS的产生，但却不能激活NLRP3炎症小体，说明ROS对于NLRP3炎症小体的激活只是必要而非充分条件。

NLRP3 炎症小体的激活机制，目前研究的仍不是很清楚，仍需要研究者们的努力。

3 真菌与炎症小体的关系

3.1 白色念珠菌（Candida albicans）：白色念珠菌是一种人体正常菌群，主要寄生在人体的体表、口腔等部位，一般情况下不会致病，当个体免疫力低下或正常菌群失调时，白色念珠菌相关的病症常发生。IL-1β是宿主抵抗病原体感染诱发的炎症因子，在感染免疫中发挥重要作用，可想而知IL-1β在真菌感染中也必然发挥重大作用。研究证实： NLRP3 能识别白色念珠菌，白色念珠菌刺激机体后可使NLRP3 炎症小体活化，诱导IL-1β加工和分泌[32-33]。白色念珠菌可以激活炎症小体。Amy等[34]和Sophie等[35]先后证实白色念珠菌对Nlrp3炎症小体有激活效应：他们用白色念珠菌分别刺激LPS预刺激过的外周血单个核细胞细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）和小鼠骨髓巨噬细胞细胞 （Bone marrow-derived macrophage， BMM），结果在上清中检测到了大量的细胞因子IL-1β。白色念珠菌的致病性不同于别的一些真菌或者细菌，因为它并不能分泌内毒素或者外毒素，所以，白色念珠菌对NlRP3炎症小体的激活也不同于细菌或者病毒对NlRP3炎症小体的激活的机制。Sophie Joly等用热灭活或者紫外灭活的菌体进行了同样的体外刺激实验，发现并不能在细胞上清中检测到细胞因子IL-1β，说明只有活体的白色念珠菌对NlRP3炎症小体有激活作用。

白色念珠菌对炎症小体的激活依赖细胞内吞作用。Sophie等用Cytochalasin D抑制巨噬细胞的内吞作用，再用活的白色念珠菌去刺激这些细胞，在上清中未检测到细胞因子IL-1β的存在。这就说明了内吞作用对于白色念珠菌激活NlRP3炎症小体至关重要。他们还发现被内吞之后的白色念珠菌，通过生长过程可破坏溶酶体，同时Ca 假菌丝可激活炎症复合体，诱导IL-1β的加工、分泌。上述研究证实了白色念珠菌在向菌丝相转变的过程中具有更强的致病性，与既往研究结论相一致。

白色念珠菌感染基因敲除小鼠的体外实验[34]。Amy 等用白色念珠菌分别感染NLRP3基因敲除、ASC基因敲除的小鼠，NlRP3和ASC基因敲除的小鼠对白色念珠菌的抵抗力显著减弱，这是因为作为NlRP3炎症小体的主要成分的NlRP3基因、ASC基因被敲掉之后，造成NlRP3炎症小体的无法形成，从体内试验的角度证明NlRP3炎症小体发挥保护作用在宿主抵抗白色念珠菌的感染中。白色念珠菌激活NlRP3炎症小体具体的分子机制目前研究的还不是很清楚，还有待于进一步的研究。但可以肯定的是，只有白色念珠菌的活体才能激活NlRP3炎症小体，在这一过程中，白色念珠菌酵母相向菌丝的转变过程，起到了至关重要的作用。

3.2 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）：烟曲霉是临床上仅次于白色念珠菌的另一种重要的条件致病真菌， 它的某些成分或者分泌的毒素可造成机体损害，如果严重的话甚至可以危及生命。Najwane Said-Sadier等分别用烟曲霉的孢子和菌丝碎片刺激THP-1细胞系，发现只有在菌丝刺激过的细胞培养上清中检测到大量的IL-1β，因此说明，烟曲霉只有在菌丝状态下才能激活NLRP3炎症小体。他们研究发现，烟曲霉只有在菌丝状态的时候才可大量地暴露出β-glucan成分，位于细胞膜上的一种ITAM样受体Dectin-1可以识别β-glucan，并激活下游的脾酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase，Syk），通过一条Syk 和髓样分化因子88（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88） 依赖的途径，活化许多重要的转录因子，其中包括对各种细胞因子的表达均起到促进作用的NF-KB（NF-KB可以促进许多细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-6、IL-2、IL-10、pro-IL-1β等）。Najwane Said-Sadier等还发现：利用Syk 激酶抑制剂抑制Syk激酶的作用之后，再用菌丝碎片去刺激处理过的THP-1细胞系，然后通过酶联免疫法分别检测pro-IL-1β和casepase-1的生成量，发现，pro-IL-1β的表达受到了影响，NLRP3炎症小体的激活也被抑制，而只抑制Dectin-1/Syk激酶途径下游物质MyD88， pro-IL-1β的表达受到影响，但是NLRP3炎症小体的激活基本无影响。这样的实验结果，使他们有理由相信，无论是在烟曲霉菌丝激活NF-KB促进pro-IL-1β的表达过程中，还是在NLRP3炎症小体的激活过程中，Syk激酶都起着十分重要的作用[35]。Paivi等[36]直接用β-glucan而非菌丝去刺激巨噬细胞系，得到了相似的结果，并在此基础上做了更深一步的研究。他们用β-glucan刺激巨噬细胞系的时候，发现细胞只有将这种成分内吞才能激活炎症小体。由此他们推测，β-glucan很有可能是通过破坏溶酶体释放cathepsin B来激活炎症小体的。所以，他们用cathepsin B抑制剂CA-074-Me抑制了cathepsin B的作用， 发现炎症小体的激活被抑制；此外，他们还分别采用丁基羟基茴香醚 （Butyl hydroxy anisd，BHA）和提高膜外K离子浓度的办法来抑制ROS的产生和K离子的外流，炎症小体同样不能被活化；另外他们用N-acetyl- cysteine （NAC）抑制ROS的作用，用增加胞外K离子浓度的方法抑制K离子的外流，之后再用菌丝刺激，炎症小体也不能够再被激活[39]。说明ROS和K离子的外流也起着重要的作用。

烟曲霉激活炎症小体具体的分子机制还有待于进一步的研究，但目前可以肯定的是，烟曲霉的菌丝由于β-glucan的存在，可以通过激活Dectin-1/Syk激酶信号通路，促进IL-1β前体的大量表达。而且，值得关注的是，Syk激酶被活化以后可以为NLRP3炎症小体的激活提供另外一个信号，在这个过程中，需要cathepsin B的参与，ROS的产生和K离子的外流也发挥着重要的作用。

3.3 犬小孢子菌（Microsporum canis）： 儿童头癣病是由皮肤癣菌感染头皮和毛发所致的浅部真菌病。近半个世纪以来，儿童头癣在新疆地区传播，发病率居全国首位。根据致病菌种、临床特点及病情严重程度的不同可遗留萎缩性瘢痕和永久性脱发。犬小孢子菌所导致的头癣临床上炎症反应较剧烈，对患儿的身心健康带来严重影响。

我们的研究团队用犬小孢子菌的整个菌丝和孢子碎片刺激THP-1细胞系和小鼠骨髓细胞[37]，刺激过的细胞培养上清中检测到大量的IL-1β，数据还显示犬小孢子菌诱导IL-1β产生是依赖Caspase-1和NLRP3炎性小体的激活，且在犬小孢子菌刺激细胞分泌IL-1β的过程中NLRP3炎性小体起了重要功能。同时，我们的数据表明，犬小孢子菌感染可能通过激活的NLRP3炎性小体进行调节。进一步的实验说明，炎症小体的激活过程中ROS和K离子的外流也起重要作用。上述结论和先前Najwane Said-Sadier等做的烟曲霉结论一致，进一步说明真菌可通过炎症小体发挥免疫应答作用。

4 展望

真菌感染后，获得性免疫对真菌起到彻底清除作用，但天然免疫在抵御真菌感染中也起重要作用，且其中各类信号通路激活后分泌各种炎性因子对后续的获得性免疫起最重要作用，Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路就是很好的代表。虽已初步证明NLRP3炎症复合体参与IL-1β等炎症因子介导的炎症反应，但如果能够更加清楚真菌感染后都有哪些天然免疫受体涉及其中，它们发挥作用的机制以及怎么联系的，这对更好地解释真菌疾病的发病机理和机体免疫系统的反应机理，无疑将是巨大的帮助。近年来，炎症小体的研究一直是免疫学领域的热点，相信真菌性疾病与这些信号通路的关联也会越来越受到大家的关注。随着人类免疫学的发展与进步，天然免疫受体信号通路一定会被人们更好地认识，而作为固有顽疾之一的真菌性疾病的临床治疗势必受到这方面知识的指导。针对性的治疗后，可以减少有皮肤及毛发受损患者的比率，使患者不会因外在形象原因而影响其社交及自信心。

真菌致病的方式比较特殊。有的与其得某一成分相关，比如：β-glucans可以被体内多种天然免疫受体识别；有的真菌菌丝和孢子居然能通过不同的途径促发不同的固有免疫信号通路。真菌形态与成分的多样性造成的不同的固有免疫促发方式多样性的例子还有很多。我们完全可以利用真菌的多样性和独特性，开发免疫疫苗和免疫佐剂。研究真菌性疾病与天然免疫受体的关系，不但能够对真菌性疾病的治疗提供新的方法，而且，还可以考虑怎样利用这些致病真菌为人类医学所用，也可能为美容界带来相关福音。

目前，天然免疫受体与真菌感染的研究还没有达到细菌、病毒与天然免疫受体研究的深度，还处于模糊的起步阶段，但相信随着科学的进步，这方面的研究必然取得长远的进步。

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[收稿日期]2014-05-10 [修回日期]2014-06-06

编辑/李阳利