不同基因型菜心游离小孢子培养和植株再生

曾小玲 方淑桂 朱朝辉 钟开勤

福州市蔬菜科学研究所，福建福州 350111

摘 要 以11个不同基因型的菜心栽培品种为试材，研究不同培养条件对菜心游离小孢子胚诱导和植株再生的影响。结果有7个基因型材料获得小孢子胚，从不同基因型诱导形成胚的频率存在显著差异，表明基因型是影响菜心小孢子胚发生的主要因素；第1天热激培养时用170 g/L高浓度蔗糖培养之后转换成含130 g/L蔗糖培养基能显著提高小孢子胚诱导率；0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促进菜心小孢子诱导成胚；添加0.4 mg/L GA3可显著提高菜心小孢子胚芽诱导率和平均每胚出芽数。7个基因型材料均诱导出再生植株，植株诱导率为100%。

关键词 菜心；游离小孢子培养；基因型；植株再生

中图分类号 S634 文献标识码A

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var.utilis Tsen et Lee.）是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的1个变种。其适应性强，可周年栽培，在我国南方大面积种植。菜心杂交育种研究起步晚，常规育种方法需经过杂交、回交和多代自交分离，选育出理想的纯系需要5～6年的时间。通过游离小孢子培养能够快速获得大量双单倍体植株（DH系），将显隐性基因成为表现型，使优良性状得到保留，大大缩短育种的年限，丰富育种资源，是一种快速、高效的育种途径。国内外研究人员对芸薹属蔬菜小孢子胚胎发生机制和影响因素做了大量研究，相继在芸薹属的多个种[1-8]上获得成功。但是不同种间游离小孢子胚诱导各有其自身的规律，不能完全相互套用。有关菜心游离小孢子培养的文献报道较少，朱允华等[9]仅从个别菜心基因型诱导出胚状体，没有形成再生植株。目前，菜心小孢子培养技术体系尚不完善，仍然有大量的具体问题需要探索。本试验通过对11个基因型菜心进行游离小孢子培养，对影响菜心胚诱导率和植株再生技术的几个关键影响因素进行探讨，培育出小孢子再生植株，进一步完善菜心小孢子培养技术，为利用现有资源快速创造所需要的新育种材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

11个供试材料分别为‘翠绿（福州永荣种子有限公司）、‘东莞2号（福州台农种业有限公司）、‘优选38号（武汉武昌神牛种苗商行）、‘华绿50天（广州华绿种子有限公司）、‘翡翠（广州市惠金农业科技有限公司）、‘绿宝（广州市农业科学研究院）、‘一枝花（广州广南农业科技有限公司）、‘501（广州市农业科学研究院）、‘翡翠尖叶（广州市惠金农业科技有限公司）、‘青翠（广东省良种引进服务公司）和‘碧绿（深圳市范记种子有限公司），均为常规种。2009年1月10日、2月28日、8月2日，2010年1月8日、2月23日、8月7日2年6批直播于福州市蔬菜科学研究所试验田，常规管理，2中旬至4月和9月选取适宜花蕾进行游离小孢子培养。

1.2 试验方法

1.2.1 游离小孢子的分离、纯化和培养 参照方淑桂等[10]的研究方法对菜心游离小孢子进行分离、纯化和培养。在菜心的始花期，于上午9 ： 00前，选取无虫眼的供试花蕾（蕾长2.0～3.0 mm，瓣药比为1/3～4/5），先用75%酒精荡洗20 s，再用有效氯含量≥8.0%的13%的次氯酸钠溶液消毒15 min，最后用无菌水荡洗3次；挑取花蕾于研钵中，加入含蔗糖130 g/L高温灭菌过的B5培养基，用研杵挤压游离出小孢子，经孔径50 μm的尼龙网布过滤收集在10 mL的玻璃离心管中；于1 000 r/min的离心机离心3 min，弃上清液，再加入10 mL的B5液体培养基悬浮小孢子，离心，弃上清液，重复3次；纯化的游离小孢子悬浮培养于NLN13液体培养基中，以每皿3 mL分装到60 mm×15 mm的无菌培养皿中，用Parafilm膜封口；将培养皿置于恒温培养箱33 ℃热激诱导24 h，之后转入25 ℃静止暗培养，至胚状体出现。培养23 d后统计小孢子出胚数，计算出胚率。当幼胚开始转绿即转至MS培养基中，置于（25±1）℃、光强3 000 lx、光照14 h/d条件下培养。

1.2.2 小孢子发育过程的形态学观察 培养的游离小孢子每天置于OLYMPUS-CX41倒置显微镜下观察。

1.2.3 不同气候条件对小孢子胚诱导的影响 以易出胚的基因型‘翠绿、‘翡翠尖叶为材料，记录取样前一天的气温，将出胚结果与取样前一天的温度对应，分析温度对菜心出胚的影响，气象资料由福州市气象局提供。

1.2.4 不同蔗糖浓度对小孢子胚发生的影响 分别以难出胚基因型‘青翠、中等出胚基因型‘碧绿和‘优选38号、易出胚基因型‘翠绿和‘翡翠尖叶为材料，参照于文佳等[11]的方法，将游离的小孢子进行3种方式处理：1）一直用含130 g/L蔗糖的NLN13培养基培养；2）用含130 g/L蔗糖的NLN13培养基热激1 d后，重新离心更换为新鲜的含130 g/L蔗糖的NLN13培养基继续培养；3）用含170 g/L蔗糖的NLN13培养基热激1 d后，重新离心更换为含130 g/L蔗糖的NLN13培养基继续培养。每个处理5皿，重复3次。23 d后统计小孢子的出胚数。

1.2.5 6-BA和NAA对小孢子胚诱导的影响 以中出胚基因型‘优选38号和难出胚基因型‘青翠单核晚期的花蕾为材料，将纯化的小孢子分别悬浮在含不同质量浓度6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）（0.05、0.10、0.15 mg/L）和NAA（萘乙酸）（0.2、0.5、1.0 mg/L）组合的NLN13液体培养基（含蔗糖130 g/L）中培养。23 d后统计小孢子的出胚数。

1.2.6 激素对小孢子胚芽继代的影响 由于扩繁需要，研究不同质量浓度的激素对再生芽的影响。采用L9（34）拉丁方设计，将‘碧绿获得的小孢子胚状体分别接种在含不同质量浓度6-BA（0.8、0.4、0 mg/L）、NAA（0.04、0.02、0 mg/L）和GA（0.8、0.4、0 mg/L）组合的9组固体培养基中（基础培养基：MS+30.0 g/L蔗糖+8 g/L琼脂），23 d后统计菜心的胚芽诱导率。胚芽诱导率=出芽胚状体数/接种胚状体数×100%，平均每胚出芽数=再生芽总数/出芽胚状体数。

1.2.7 小孢子胚芽的生根及驯化移栽 再生芽长至2 cm左右时，切下芽，并转入生根固体培养基（1/2MS+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+8 g/L琼脂）中生根，长成小苗，植株经驯化后移栽到苗床。

1.3 数据分析

利用DPS6.5软件对数据进行差异显著性分析，Graphpad5.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 小孢子离体培养过程的形态学观察

从OLYMPUS-CX41倒置显微镜观察菜心游离小孢子发育过程的形态变化。刚游离的小孢子大部分呈近圆形，具有3条萌发沟，细胞核被大液泡挤到细胞一侧，处于单核靠边期。经热激诱导处理1 d后，部分小孢子明显膨大，细胞增大到原来的2倍左右，形状为圆球形（图1-a）。3 d后，部分膨大的小孢子开始第一次细胞分裂，再经横向和纵向多次分裂，培养7 d分裂形成细胞团。10～16 d细胞团进一步发育形成球形胚、心形胚（图1-b）、鱼雷形胚、子叶胚，最后形成不同形状的胚状体（图1-d）。部分膨大的小孢子为横向均等分裂，继续分裂形成多细胞团（图1-c），逐渐形成肉眼可见的愈伤组织，这些愈伤组织的细胞之间松散而无序的连接在一起。可见菜心游离小孢子发育过程存在胚状体途径和愈伤组织途径的2种不同途径。

2.2 不同基因型小孢子胚诱导的差异比较

由表1可见，供试的11份材料中有7个基因型诱导出胚，占63.6%。其中‘翠绿和‘翡翠尖叶每蕾出胚数较高，分别为8.06胚/蕾和6.28胚/蕾；‘东莞2号、‘青翠和‘华绿50天的出胚数相对低些，均在1.50胚/蕾以下；‘翡翠、‘501、‘绿宝和‘一枝花在NLN13培养基中未诱导出胚，不同基因型的菜心小孢子出胚数有极显著差异。根据小孢子出胚数的不同，可以把11个材料划分为4类：易出胚基因型‘翠绿和‘翡翠尖叶，平均出胚数大于5.0胚/蕾；中等出胚基因型‘碧绿和‘优选38号，平均出胚数为1.5～5.0胚/蕾；难出胚基因型‘东莞2号、‘青翠、‘华绿50天，平均出胚数为0～1.5胚/蕾；不能出胚基因型‘翡翠、‘501、‘绿宝和‘一枝花。在不能出胚的4个基因型中，观察到‘一枝花的游离小孢子发生膨大和分裂，说明其具有产生胚状体的潜力，可能是培养基中的某些外因抑制细胞团的继续发育；‘501只观察到细胞的膨大，说明‘501基因型对培养条件有一定的反应，但是细胞不能进一步分裂。在相同的处理条件下，游离小孢子胚的发生能力是受基因型调控的。

2.3 供体植株气候条件对小孢子胚诱导的影响 由表2可见，供体植株的气候条件对小孢子胚的诱导具有明显影响。植株在夜间最低气温低于10 ℃和日间最高气温高于30 ℃条件下，小孢子诱导率大大降低。在夜间最低气温处于12 ℃左右，日间最高气温处于24 ℃左右胚诱导率较高，这段时间比较适合菜心游离小孢子培养。2月份和3月份的胚诱导强于9月份，9月份的出胚数量极少。

2.4 培养基的蔗糖浓度对菜心小孢子胚诱导的影响

图2显示，不同蔗糖浓度处理对难出胚基因型‘青翠、中出胚基因型‘碧绿和‘优选38号的出胚数造成极显著差异，但对易出胚基因型‘翠绿和‘翡翠尖叶则无显著影响。其中对于难出胚基因型‘青翠，处理1和处理2不能诱导形成胚，处理3则能够诱导形成胚，且出胚数达到每蕾0.97个；对于中出胚基因型‘碧绿和‘优选38号，处理1和处理2能够不同程度地提高小孢子出胚数，以处理3效果最好，出胚数比处理1每蕾分别多2.72个和2.73个；易出胚基因型‘翠绿和‘翡翠尖叶对高糖处理的影响不大，处理3分别比处理1每蕾仅多0.29个和0.16个。

2.5 6-BA和NAA对小孢子胚诱导的影响

表3表明，添加适宜质量浓度配比的生长调节剂有利于提高菜心游离小孢子的产胚量，其中对不易出胚基因型的促进作用更加明显。‘优选38号的产胚数从每花蕾1.06个增加到3.77个，提高了2倍多。在诱导培养基中附加0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA促进了难出胚基因型‘青翠诱导出胚。菜心诱导培养基中最适宜激素质量浓度配比是0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA。说明生长调节剂是影响小孢子胚发生的重要因素之一，不同基因型要求的植物激素组合和浓度不尽相同。

2.6 激素对胚状体继代的影响

将‘翠绿培养得到的生长良好的转绿胚状体（图3-a）转接到MS固体培养基上扩繁培养，产生丛生芽。经试验研究（表4），在MS固体培养基中添加6-BA、NAA和GA3都能诱导出不定芽，胚芽诱导率在2.41%～58.53%，平均每胚出芽数在0.69～6.61，不同质量浓度激素组合处理间呈极显著差异。其中添加0.4 mg/L GA3最有利于不定芽发生，胚芽诱导率最高，达到58.53%，平均出芽数为每胚6.61个，比其他处理形成的植株较粗壮（图3-b），再经过2～3次继代后进行生根培养形成小孢子幼苗。只添加NAA的继代培养基中，胚芽诱导率最低，有些胚状体在培养过程形成愈伤，最终褐化死亡（图3-c）。添加6-BA和NAA的继代培养基中，菜心小孢子的胚芽发生速度较慢，植株较弱，胚芽诱导率偏低。逐渐提高GA3的浓度，菜心胚芽的分化受到明显抑制，在添加0.8 mg/L GA3的MS培养基中，菜心叶子慢慢变大变厚，形成很多次生胚。将幼苗转接到1/2MS+0.3 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+8 g/L琼脂的生根培养基上培养获得健壮的植株（图3-d）。由此可见，适宜的激素浓度对不定芽的再生具有明显促进作用，激素浓度过高或不适宜都会抑制胚芽的扩繁。菜心小孢子胚芽继代的最适培养基是MS+0.4 mg/L GA3。

3 讨论与结论

菜心基因型是影响小孢子培养的关键因素之一。在相同处理条件下，供试的11个基因型材料中有7份形成了小孢子胚，诱导成功率为63.6%，表明菜心的基因型决定了出胚率，基因型的反应范围较高，这与前人[12-13]的研究结果相同。在实际工作中可以将容易培养的基因型与难培养的基因型杂交，通过遗传改良的方法扩大小孢子胚胎发生的基因型范围，获取有用的基因。这种设想陈文辉等[14]在甘蓝上进行了尝试，并获得了成功。在菜心上的应用目前还没有报道，有待于今后的摸索，实现对优良性状基因型的成功培养。

植株的生长环境也是影响小孢子培养成败的因素之一，健康生活力强的供试植株是小孢子培养的基础，植株生长环境如气温、光周期和光照条件影响胚或胚状体的产量[15]。多数芸薹属植物生长在较低温（日/夜，10 ℃/5 ℃）有利于小孢子的培养[16-17]。张凤兰[18]发现生长在14～18 h长日照，15～20 ℃条件下的大白菜‘HoMei植株，胚状体发生率和植株再生率高。方淑桂等[19]证实在10～25 ℃下生长的大白菜植株有利于小孢子培养。菜心多数品种对光周期要求不严格，花芽分化主要受温度影响。本试验研究结果表明当昼夜气温在12～24 ℃时菜心胚诱导率较高，在夜温低于10 ℃或日温高于30 ℃时均不利于菜心游离小孢子的出胚；春季的夜温比秋季的夜温低，导致小孢子培养时的脱分化能力的提高。推测气温变化会改变小孢子的内源激素水平从而影响胚的发生，影响了小孢子发育的方向。菜心植株应在适宜大田温度条件或在人工气候室中栽培有利小孢子培养工作开展。

培养基中蔗糖的供应对小孢子的发生起着碳源、能源和调节渗透压的重要作用，在小孢子培养研究中前人[20-21]多有讨论。方淑桂等[21]研究花椰菜游离小孢子培养试验表明太高或太低蔗糖浓度都不利于小孢子存活，胚诱导频率最高的培养基蔗糖为130 g/L。本试验游离小孢子热激培养1 d时采用含170 g/L蔗糖的培养基，之后更换为含130 g/L蔗糖的诱导培养基继续培养，青翠等不易出胚基因型的游离小孢子培养反应比较积极，小孢子膨大快，小孢子的出胚数得到显著的提高；可能是刚游离的小孢子需要高浓度蔗糖来保持渗透压，之后转入低浓度蔗糖是促进细胞的进一步分裂。

现在越来越多的试验证明添加适当浓度的激素可以促进细胞生长、分裂和不定芽的形成。冯辉等[22]研究了NAA和6-BA的不同质量浓度配比对胚诱导、胚再生、植株生根的影响。本试验结果表明，不同激素组合和浓度对不同基因型小孢子出胚数的影响有显著差异，在NLN13诱导培养基中附加0.05 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA能够极显著的诱导小孢子出胚数；继代培养基中添加低质量浓度GA3可以促进菜心胚芽长成数量多的不定芽，但高质量浓度的GA3对小孢子胚的继代产生有抑制作用。

总之，影响小孢子培养和再生植株获得的因素很多[23-26]，菜心小孢子培养技术需要进一步的研究与验证，以便加快应用于生产。

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