利用RAPD标记分析咖啡种质资源的遗传多样性

黄丽芳 董云萍 王晓阳 陈鹏 林兴军 范睿 闫林

摘 要 通过引物筛选获得18条RAPD多态性引物，利用该引物对72份咖啡种质资源进行RAPD扩增，共扩增出149条条带，其中多态性条带126条，多态性位点为84.6%。运用UPGMA方法构建了聚类图，在相似系数0.632的水平下可将72份资源聚为3个大类，其中A类群包含了所有的中粒种资源（Coffea canephora Pierre）及一份由云南德宏所选育的中小粒种杂交种（阿拉伯斯塔），共34份咖啡种质资源；B类群包括了6份查理种（Coffea excelsa Chevalier）和大粒种（Coffea liberica Bull ex Hiern）；C类群由小粒种（Coffea arabica. Linne）咖啡组成。结果说明咖啡种质的遗传关系种间容易划分，在种的分类水平上存在遗传关系多样性，部分资源的分类学地位与地理来源无相关性。

关键词 咖啡；RAPD；遗传多样性

中图分类号 S571.2 文献标识码 A

咖啡与可可、茶同列世界三大饮料作物，其主要栽培品种为小粒种（C. arabica L .）和中粒种（C. canephora Pierre）。另外的2个品种大粒种（C. liberica Bull ex Hiern）和查理种（C. excelsa Chevalier），因品质较差，很少作为商业栽培。目前，咖啡已是许多地区经济发展的支柱产业[1]。国内咖啡主产区在云南和海南，已在中国热带农业科学院香料饮料研究所及云南德宏热带农业科学研究所建立了咖啡种质圃，收集了从墨西哥、喀麦隆、马来西亚等地引进的咖啡种质200多份。因种质资源多为外引的栽培品种或大田选择的变异单株，因而种质资源相对匮乏，遗传基础狭窄，且中国对咖啡种质的鉴定评价研究较浅，还未开展对咖啡种质资源遗传特性的研究，致使咖啡新品种选育速度缓慢。

分子标记是一种快速高效的遗传分析方法，可有效排除环境因素和观察标准的误差。国外利用RAPD、AFLP、SRAP、SSR和EST-SSR等技术针对小粒种或中粒种咖啡进行主栽品种、杂交群体的遗传特性、遗传关系以及品种的鉴定[2-5]。中国学者莫饶[6]用11对SSR引物构建了12份咖啡品种的SSR指纹图谱，但许多品种资源的分类地位及亲缘关系尚不清楚，不利于进一步利用现有资源开展育种工作。

随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA， RAPD），是研究遗传多样性的有力工具，比AFLP、SRAP操作简便、快捷、成本低，比SSR产物多态性丰富，具有扩增多态性好，灵敏度高，对DNA序列不要求了解等优点[7-10]。RAPD标记不足之处就是受反应条件影响较大，检测的重复性较差，使得不同研究者的研究结果难以比较，但可以通过建立一个稳定性好、重复性高的RAPD-PCR反应体系进行优化，以及反复试验，选择重复性好的条带录入数据，即可克服重复性差的弱点，增加试验的可靠性[11]。Anthony等[12]利用RAPD标记研究了埃塞俄比亚咖啡起源中心代表88份种质的119株小粒种咖啡的遗传多样性，用29个多态性片段计算相似性指数和构建“树状图”。本研究对收集到的72份咖啡资源进行遗传多样性研究，利用RAPD技术分析了咖啡种质资源亲缘关系，为鉴定咖啡种质资源遗传性状、筛选适宜的杂交亲本、核心种质的建立提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

72份咖啡种质资源见表1，其中中粒种资源32份，小粒种32份，大粒种3份，查理种3份，中小粒种杂交种1份，还有1份来自福建的资源分类不明确。编号1-61，67-72取自中国热带农业科学院香料饮料研究所咖啡种质资源圃（海南兴隆），其中编号1-19为该所选育的高产无性系，编号62-66取自海南省澄迈县。72份材料分别来源于中国云南、海南等5省份，以及喀麦隆、墨西哥等11个国家。试验于2012年在农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室进行，选取健康植株上的无病虫害成熟叶片，液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 基因组DNA的提取参照黄丽芳等[13]的CTAB改良法。提取的基因组DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测质量，稀释至20 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物筛选及RAPD扩增 选取RAPD引物S1-S100共100条随机引物。利用4份差异较大的咖啡（27号、台湾小粒、大粒、M10）模板进行引物筛选，选取多态性好且扩增条带清晰的引物用于本试验。使用郎基LK200梯度PCR仪进行RAPD反应，PCR反应体系为本课题组优化过的咖啡RAPD反应体系[14]：基因组DNA 20 ng，dNTPs 0.3 mmol/L，Taq酶1.25 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，10×buffer 2 μL，双蒸水补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，38 ℃ 1.75 min，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。PCR产物加入3 μL溴酚蓝，1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，试验重复2次。

1.3 数据分析

根据引物扩增产物在琼脂糖凝胶中迁移率的不同，对电泳结果统计。相同迁移位置，重复性、清晰度好的扩增条带赋值“1”，无条带或肉眼不易分辨的弱带赋值“0”，采用NTSYSpc 2.1软件，根据Nei和Li相似系数计算遗传相似系数GS（genetic similarity），根据非加权算术平均法（UPGMA）进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 RAPD引物筛选与扩增片段多态性

通过4份性状差异较大的咖啡品系扩增（图1），从100条RAPD随机引物中筛选出18条多态性好且扩增条带清晰的引物。

利用筛选出的18条引物对72份咖啡材料进行RAPD扩增，共扩增得到149条DNA条带（表2），多态性带126条，占所观察到总扩增带的84.6%。不同引物扩增获得的多态性条带数量在4～12条之间，平均每个引物扩增出7条多态性条带，各条引物检测到的多态性条带比例为62.5%～100%，扩增条带分子量多数为500～1 800 bp。其中引物S19扩增出12个位点的条带，扩增条带数最多，多态性比率为100%（图2）；引物S25、S28、S46、S75扩增总带数最少，为6条。

2.2 遗传相似系数

72份咖啡资源的遗传相似系数在0.364 4～0.974 6之间。根据遗传相似系数可知不同种质亲缘关系的远近，从表3可以看出，所有种质间均有不同程度的遗传差异。兴33和云南贡山-2的遗传相似系数最小（0.364 4），表明遗传距离最远，遗传差异最大；兴2小粒种和CTM19的遗传相似系数最大（0.974 6），表明遗传距离最近，遗传差异最小。同一种质资源内个体间也存在不同程度的差异，其中石垄坡个体间差异最大，个体间平均遗传相似系数为0.529 7，个体间最小遗传相似系数为0.423 7，最大遗传相似系数为0.923 7。而卡蒂莫（巴西）个体间差异最小，平均遗传相似系数为0.679 7，个体间最小遗传相似系数为0.432 2，最大遗传相似系数为0.957 6。

2.3 聚类分析

聚类分析显示，在相似系数0.632水平下，全部材料可以分为3大类，A类群包括来自海南兴隆、越南、巴布亚新几内亚、马来西亚、泰国、印尼、福建的全部中粒种资源，以及一份由云南德宏所选育的中小粒种杂交种（阿拉伯斯塔），共34份咖啡种质资源；B类群包括了来自海南文昌和兴隆的6份查理种和大粒种；C类群包括了来自巴西、墨西哥、马来西亚、印度、喀麦隆、哥伦比亚、葡萄牙、广西、云南德宏、海南的32份小粒种咖啡（图3）。

A类群由全部供试的中粒种种质组成，在相似系数为0.675时，一份来自福建的种质单独成为一分支，其他的33份资源在0.726为相似系数时又分为两个支，来自海南兴隆、越南、马来西亚、泰国等地的咖啡资源聚为一类，阿拉伯斯塔、印尼及一份来自巴布亚新几内亚的资源聚为另一类。

B类群的种质受来源地的影响较为显著，遗传相似系数范围为0.705～0.958。在0.915为截值时，来自海南文昌的南顶、大粒种和石垄坡聚为一类，与查理小果、查理大果在0.871截值时聚为一个分支，而查理中果则在0.705时与其他5份种质进行聚类。

C类群包含了全部的小粒种咖啡，在相似系数0.748时，分为2个分支，其中一支有来自台湾南部、台湾中部、云南贡山-1和云南贡山-2，共4份种质；另一分支有来自巴西、喀麦隆、广西等地共28份种质。

3 讨论

通过分析发现，72份咖啡资源分为3大类，相似系数0.364 4～0.974 6之间，说明这些材料遗传基础相对较宽，存在较大的遗传变异性。

A类群遗传相似系数范围在0.675～0.898之间，种内遗传多样性较丰富，遗传背景较复杂。这可能与中粒种咖啡是异花授粉有关，在长期的繁殖过程中，产生并积累了大量的不连续变异。Hamrick等[15]经过研究发现，多年生异花授粉植物具有较高水平遗传多样性，在种内水平上这种现象尤为明显。

Anthony等[16]用37对AFLP引物和6对SSR引物研究了26份栽培和半野生小粒种的遗传多样性，结果表明，AFLP和SSR的聚类情况相似，半野生小粒种的多态性较栽培种的高，但总体的遗传基础较窄，本研究中也发现，小粒种咖啡的亲缘关系较紧密，遗传相似系数为0.748～0.974，遗传多样性不明显。聚类分析表明，A、B、C类群种间关系清晰，查理种、大粒种、中粒种及小粒种聚类得到的结果与经典分类结果较为一致。

咖啡资源的遗传关系与资源来源地有关，与植物学分类学特性、长期的人工种植、栽培环境、果实的大小、用途等[17-20]具有一定的相关性。72份资源的聚类结果表明，不同国家（地区）咖啡资源有聚在一起的趋势，但也有材料偏离所属国家（地区）的现象，如C类群的小粒种资源，台湾南部、台湾中部和云南贡山的2份资源聚为一个分枝，而台湾小粒种在另一分枝，差异较大，说明同一地区的种质间存在遗传差异。导致划分的类群与其来源地相关性不明显的原因，可能是广泛的种质起源以及漫长的进化，也可能是长期人工选育的结果[21]。

本研究发现咖啡的遗传关系若仅由种质材料来源区域的远近和生产上品种的名称、外形来判断无疑难以得到确切的分类信息。通过RAPD标记分析结果表明，72份咖啡资源存在遗传差异，种间容易划分，但在种内分类水平上，小粒种遗传关系较紧密，多样性不明显，而中粒种咖啡遗传多样性丰富，与小粒种咖啡有明显的区别。此外，研究还表明部分咖啡资源的遗传关系与其地理来源并无相关性，这也反映了咖啡产地对其分类学地位的影响不显著。

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责任编辑：赵军明