调控橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因转录因子的初步筛选

郭冬 李辉亮 杨子平 彭世清

摘 要 为研究橡胶树中法尼基焦磷酸合酶基因（HbFPS）的表达调控机制，采用酵母单杂交技术筛选了胶乳中与HbFPS启动子结合的蛋白因子。将HbFPS启动子与报告质粒pHIS2.1连接构建诱饵质粒pHis-FPS，经筛选确定抑制背景表达的3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）浓度为10 mmol/L。同时以橡胶树胶乳mRNA为模板合成双链cDNA，并将双链cDNA、线性化的pGADT7Rec2载体和诱饵质粒pHis-FPS共同转化酵母菌株Y187，两载体共转化效率为1.7×106 cfu/μg。筛选共得到阳性克隆36个，获得31条序列。对获得的cDNA序列进行生物信息学分析，得到2个转录因子序列，分别为类乙烯响应转录因子ERF003和HbLMYC2。结果为进一步研究HbFPS表达调控机制奠定基础。

关键词 橡胶树；法尼基焦磷酸合酶；转录因子

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPS）是植物类异戊二烯合成途径中的一个重要关键酶，催化2分子的异戊烯基焦磷酸和1分子的二甲基丙烯基焦磷酸以1，4头尾连续缩合反应，形成15碳的法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）[1]。FPP是植物体内甾醇、三萜、长醇、泛醌、类胡萝卜素、橡胶等许多萜类衍生物质的合成前体[2]。目前在植物中关于FPS的研究主要集中在基因克隆、表达特性分析和过量表达对次生代谢产物的影响[3-6]。研究结果表明，FPS的过量表达会提高次级代谢产物的产量[7-8]，在青蒿（Artemisia annua）中过量表达AaFPS，转基因植株中青篙素的含量比对照组高30%左右[9]；Chen等[10]将棉花的FPS在青篙中过量表达，转基因发根系中青篙素含量约为对照组的3～4倍，转基因植株中青篙素的含量比对照组高2～3倍；在积雪草（Centella asiatica）过量表达来自人参的FPS，转基因植株中植物甾醇和三萜烯含量有明显的提高[4]。而对FPS转录水平上调控因子的研究尚未见报道。

天然橡胶的生物合成是一种典型的植物类异戊二烯的次生代谢途径。同位示踪术和核磁共振成像技术的研究结果表明，FPP是橡胶生物合成的起始物[11]。橡胶生物合成的速率与细胞内的FPP浓度呈正相关，FPP浓度越高，橡胶合成的速率越大[12]。由于HbFPS是天然橡胶生物合成途径中的一个重要关键酶，因此，研究HbFPS的表达调控机制对促进天然橡胶生物合成有重要意义。寻找与HbFPS调控序列中顺式作用元件特异结合蛋白，是进一步研究HbFPS表达调控机制的关键。酵母单杂交系统是目前广泛应用于克隆和鉴定动植物转录因子的有效方法。本研究在分离HbFPS 5′调控序列的基础上[13]，通过酵母单杂交技术筛选得到与其结合的蛋白，以期为获得调控HbFPS表达的转录因子并研究其调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）7-33-97种植于中国热带农业科学院试验农场。采集幼叶进行橡胶树基因组DNA提取。胶乳采样按Tang等[14]的方法进行，再用液氮收集。

1.1.2 质粒、试剂和菌种 克隆载体pMD19T simple Vector、限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。mRNA 分离和纯化试剂盒polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit、IPTG、X-gal和dNTPs购于promega公司。酵母单杂交系统MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit购自Clontech 公司。E.coli DH5α由本实验室保存。DNA合成和测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HbFPS启动子诱饵载体的构建与鉴定 根据pHIS2.1多克隆位点信息，对前期报道的HbFPS启动子序列[13]进行酶切位点分析，设计一对特异上游和下游引物，并分别引入MluⅠ和SpeⅠ酶切位点，引物序列为pFPSF：5′-CCGACGCGTCTGCAT

TTTTATGATTAA-3′和pFPSR：5′-GCGACTAGTGG

ATTCAAACGGAGATTAG-3′。以橡胶树基因组DNA为模板进行PCR反应。反应体系：在0.2 mL的离心管中加入1 μL DNA、10×PCR反应缓冲液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 5 min。将纯化的PCR产物克隆至pMD19T simple Vector，转至DH5α，抽提质粒，测序鉴定，获得重组质粒pMD19-FPS。将pMD19-FPS用MluⅠ和SpeⅠ进行双酶切并回收目标片段，连接到经相同酶切的pHIS2.1载体上，连接产物转化至DH5α，抽提质粒用MluⅠ和SpeⅠ双酶切鉴定，获得HbFPS启动子诱饵载体pHis-FPS。

1.2.2 酵母单杂交诱饵载体背景表达抑制剂浓度的筛选 按照MatchmakerTM One-hybrid Library Construction & Screening Kit的操作说明，使用醋酸锂转化法，将诱饵载体pHis-FPS转化到酵母菌株Y187中，将转化液涂布于含不同浓度（0、5、10、20、30、40、60、80、100 mmol/L）3-氨基三唑（3-aminotriazole，3-AT）的酵母营养缺陷性培养基SD/-His/-Trp选择培养平板上，30 ℃培养5～10 d后，观察酵母生长情况。

1.2.3 胶乳总RNA的提取和双链cDNA的合成

橡胶胶乳总RNA的提取参照Tang等[14]的提取方法进行。按照polyATtract mRNA Isolation Systems III Kit的操作说明分离纯化mRNA。应用MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit对所获得mRNA进行反转录，得到末端含SMARTTM Ⅲ和CDSⅢ接头的双链cDNA。将获得的双链cDNA经CHROMA SPINTM TE-400树脂层析柱（Clontech公司）纯化后备用。

1.2.4 cDNA文库质粒转化酵母细胞 按照MatchmakerTM One-hybrid Libray Construction & Screening Kit的操作要求，将5 μg诱饵载体质粒pHis-FPS、20 μL双链cDNA和3 μg经SmaⅠ线性化的融合表达载体pGADT7-Rec2，用LiAc/PEG法共转化至酵母菌Y187感受态细胞中。将转化后的酵母细胞用6 mL 0.9% NaCl溶液重新悬浮，再按1/10、1/100和1/1000的比例分别稀释，从稀释液里各取100 μL分别涂布在SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Leu/-Trp平板上培养，用于计算转化效率。剩余酵母细胞悬浮液按100 μL每皿涂布在营养缺失培养基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上筛选阳性克隆。平板放置30℃培养5～10 d后，观察酵母生长情况。

1.2.5 酵母单杂交阳性克隆的筛选鉴定 根据pGADT7-Rec2载体中双链cDNA插入区段两侧序列设计一对上下游引物S1：5′-TTCCACCCAAGCA

GTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′和S2：5′-GTATC

GATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3′。选取营养缺陷培养平板上生长直径大于1 mm的酵母菌落进行菌落PCR筛选，PCR反应体系：在0.2 mL的离心管中加入少量酵母菌落、10×PCR反应缓冲液（含MgCl2）2 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 μmol/L引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O至20 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，共30个循环。取7 μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR鉴定的阳性克隆重新在营养缺失培养基SD/-Leu/-Trp/-His/10 mmol/L 3-AT上划线培养，连续分离3代，通过酵母菌落PCR的方法选择出同时具有文库载体和诱饵载体的克隆。

1.2.6 阳性克隆序列分析 将鉴定为阳性克隆的PCR产物克隆至pMD19T载体上，转至DH5α，提取质粒，经PCR验证后测序。将测序结果进行blastx比对分析，确定目的基因所编码的靶蛋白及其生物学功能。

2 结果与分析

2.1 HbFPS启动子诱饵载体的构建

以橡胶树基因组DNA为模板，PCR扩增获得长约1.1 kb的HbFPS启动子目标片段（图1）。PCR产物连接到pMD19T 载体后用MluⅠ和SpeⅠ双酶切质粒验证，切下约1.1 kb片段，与目标带型大小一致（图2），阳性克隆测序结果与HbFPS启动子序列完全相同，表明HbFPS启动子诱饵载体构建成功，命名为pHis-FPS。

2.2 诱饵载体pHis-FPS背景表达抑制剂浓度的筛选

将诱饵载体pHis-FPS转化到酵母菌株Y187中，在含有不同浓度3-AT的SD/-His/-Trp选择培养平板培养3～5 d后，观察发现3-AT浓度达到20 mmol/L及以上时，几乎没有克隆长出，10 mmol/L时有少量克隆长出，5 mmol/L时长出克隆较多。又将SD/-His/-Trp选择培养平板中分别加入4、6、8、10 mmol/L的3-AT再次筛选，结果显示3-AT浓度为10 mmol/L时仍然只有少量克隆长出（图3），因此将10 mmol/L的3-AT浓度作为酵母单杂交诱饵载体背景表达抑制剂浓度。

2.3 酵母单杂交双链cDNA的合成

1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的橡胶树胶乳总RNA，结果显示，总RNA有2条清晰的条带（图4），条带均无拖尾现象，表明总RNA的提取未发生降解。紫外分光光度计测量样品OD260/OD280=1.97，浓度为10.13 mg/mL，表明总RNA纯度较高。将总RNA分离纯化得到mRNA，经反转录获得末端含SMARTTMⅢ和CDSⅢ接头的双链cDNA，并纯化，1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，纯化后的双链cDNA片段大小分布在300～2500 bp之间（图5）。

2.4 酵母单杂交文库的构建和初步筛选

将纯化后的双链cDNA、诱饵载体质粒pHis-FPS和线性化的融合表达载体pGADT7-Rec2，共转化至酵母菌Y187感受态细胞中，分别涂布在SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu和SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT的固体培养基中，培养5～10 d后发现，SD/-Trp、SD/-Leu和SD/-Trp/-Leu平板上均有较多克隆长出，表明诱饵载体质粒pHis-FPS和线性化的融合表达载体pGADT7-Rec2同时转入了酵母菌Y187细胞中。统计SD/-Trp/-Leu平板上共长出克隆284个，2种载体的共同转化效率为1.7×106 cfu/μg。SD/-His/-Leu/-Trp/10 mmol/L 3-AT平板共长出直径大于1 mm的酵母菌落45个。

2.5 阳性克隆筛选和基因功能注释

使用载体特异引物S1和S2对45个直径大于1 mm的酵母菌落进行菌落PCR筛选，共36个克隆扩增出清晰条带，均大于350 bp（空载体引物约300 bp）。其中扩增条带大于1 kb的克隆有12个，大于750 bp的克隆14个，大于350 bp的克隆10个。图6为部分酵母菌落PCR检测结果。PCR扩增产物连接到T载体pMD19T上，筛选阳性克隆进行测序。共测序36条，除去因特殊结构未测出序列，共获得31条可读序列。

将获得序列去除载体后，使用NCBI数据库中的Blastx工具进行同源比对分析。去除匹配重复的蛋白序列后，筛选到的蛋白多为功能未知蛋白。经过多次筛选，得到2个转录因子序列可能与HbFPS启动子序列结合：一个序列编号FPSYOH12，共分离cDNA序列623 bp，推导最大编码171个氨基酸，其中2～40 aa预测为AP2/ERF类转录因子保守结构域，blastx比对结果显示，该序列与葡萄中乙烯响应转录因子ERF003（登录号：XP002285373）同源性为76%（图7-a）；另一个序列编号FPSYOH26，共分离cDNA序列624 bp，推导最大编码180个氨基酸，其中9～59 aa预测为bHLH类转录因子保守结构域，blastx比对结果显示，该序列与橡胶树HbLMYC2 cDNA序列（登录号：HM061097）同源性高达为97%（图7-b）[15]。

3 讨论

转录因子作为一种DNA结合蛋白，通过与基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用，调节基因表达的强度或控制靶基因的时空特异性表达，应答激素刺激和外界环境的胁迫，在植物生长发育过程中起到重要的调控作用。酵母单杂交技术根据体内DNA结合蛋白与顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理，已成为分离转录因子的有效手段。本研究将HbFPS的启动子区段构建到酵母单杂交诱饵载体pHIS2.1上，以期获得能够调控HbFPS基因的转录因子。结果显示，笔者初步筛选得到乙烯响应转录因子ERF003和bHLH类转录因子HbLMYC2与HbFPS启动子区段结合。ERF转录因子是植物中特有的一类转录因子，是AP2/ERF类转录因子超级家族中的一个亚家族，ERF类转录因子基因受多种植物激素诱导，如乙烯、脱落酸、茉莉酸和水杨酸等，干旱、盐碱、低温、病害、机械损伤等生物与非生物胁迫也会诱导其表达。ERF类转录因子参与植物体内多种信号转导途径，在植物体的抗逆性调控中发挥着不可替代的作用，同时在调控植物的生长发育中也发挥着作用[16]。MYC转录因子家族是bHLH超家族的一种，是植物激素（如茉莉酸、乙烯、脱落酸等）响应途径中的核心转录因子，具有多种调节功能，并广泛存在与动植物中[17]。MYC2是已发现植物MYC类转录因子中研究最为深入的一个，拟南芥MYC2转录因子通过形成COI1/JAZ/MYC2复合体发挥调控作用，参与茉莉酸、脱落酸等植物激素信号转导过程[18]。最近研究结果表明，MYC2转录因子受赤霉素和茉莉酸信号的协同调控，直接激活拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11来调控倍半萜的合成和释放，促进拟南芥花中倍半萜的合成[19]。通过对HbFPS启动子序列的顺式作用元件分析，该区段含有响应乙烯的顺式作用元件ERELEE4（AWTTCAAA，-1027）和MYC的顺式作用元件（CANNTG，-936）[20-21]，笔者推测所获得转录因子与这些元件结合，从而响应上游转导信号对HbFPS表达调控，但具体的结合元件和调控机理还有待进一步验证和研究。

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责任编辑：赵军明