定性PCR方法检测转基因玉米MON810转化事件的研究

易小平 贺萍萍 夏启玉 肖苏生 谢翔 杨小亮 李美英 郭安平

摘 要 转基因玉米MON810（YieldGardR）是孟山都公司通过DNA重组技术和微注射轰击研发的一种具有对欧洲玉米螟（ECB；Ostrinia nublialis）有特殊抗性的转基因玉米品系，目前在世界各地已经得到广泛种植，为加强对该品系玉米的安全管理，本研究旨在建立MON810品系玉米的转化事件特异性定性PCR检测方法。根据MON810的插入序列信息，在3′端的侧翼序列处设计定性PCR检测的引物，检测MON810在其他几种常见转基因作物混合样品的特异性。结果表明，该方法具有很好的特异性。同时检测该引物系统的扩增灵敏度，结果表明，检测引物的灵敏度可达0.1%。建立的MON810特异定性PCR检测方法经全国7家实验室的验证，进一步证实该方法能够特异地检测出样品中的MON810转化事件，检测方法的灵敏度可达0.1%，且检测结果具有良好的可重复性和可重现性。MON810转化事件定性PCR检测方法的建立可满足于抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全管理的需要。

关键词 转基因玉米MON810；定性PCR；灵敏度；特异性

中图分类号 S19 文献标识码 A

玉米是大宗粮食作物，又是重要的饲料和工业原料，由于虫害的威胁，导致其产量和质量严重下降。其中玉米螟是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米螟危害造成玉米产量损失在5%左右。中国是玉米螟的多发和重发区，20世纪70年代以来，几乎每2 a就大发生1次，年损失玉米380～640万t，相当于一个中等省玉米的产量。而MON810（YieldGardR）玉米是孟山都公司研发的一种具有对欧洲玉米螟（ECB；Ostrinia nublialis）有特殊抗性的转基因玉米品系，能保护玉米免受欧洲玉米螟ECB幼虫对茎叶的损害。因此MON810玉米自1996年在美国得到批准商业化种植以来，相继在欧洲、加拿大、阿根廷、澳大利亚、日本等多个国家和地区受到种植业主的欢迎[1-2]。2005年后，中国允许进口MON810玉米用于加工饲料。MON810玉米的研发给人们带来很大的收益和便利，但是其安全性问题目前仍存在着很大的争议[3-6]，MON810玉米的种植曾在法国和德国得到禁止[3]。因此为加强MON810玉米的安全管理，对MON810玉米品系的特异性检测研究也具有重要的现实意义。

目前对转基因产品的检测主要分为2类，一类是基于核酸水平的检测方法（如定性和定量PCR方法），另一类是基于蛋白的检测方法（如ELSA方法）。定性PCR方法具有高特异性，较高的检测灵敏度，检测的成本较低，因而是目前转基因成分检测最常用的方法[7-8]。MON810玉米自商品化种植以来，MON810玉米的转基因成分检测也备受关注。2003年，曹际娟[1]首先利用筛选检测转基因产品的CaMV35S启动子检测到了195 bp的扩增产物，又在质粒载体插入玉米基因组的5′的侧翼序列设计了1对MON810转化体特异性检测引物，其中上游引物在玉米的基因组位置，下游引物在CaMV35S启动子位置，扩增片段大小为170 bp。近年来，环介导的等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）在MON810玉米转化事件的检测中也得到探讨[9]。目前有关MON810检测的荧光定量PCR方法也有很多报道[10-11]。但荧光定量PCR方法检测转基因成分的成本较高，不能得到普遍应用。基于以上分析，MON810转化事件定性PCR检测方法的研究更具有实际应用意义。Moon等[12]建立了特异扩增MON810 转化事件的80 bp的新的定性PCR的引物系统。农业部869号公告-9-2007有关MON810 转化事件的检测标准的扩增产物为106 bp[13]，这些检测方法扩增片段太小，不易与引物二聚体分开，并且还有明显的非特异性扩增现象，在对MON810转基因成分的判定时容易误判。

为了更好地防止转基因玉米MON810的流转散失，本研究根据转基因玉米MON810的3′端侧翼序列，建立了新的抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法，为转基因玉米MON810的生物安全管理提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与样品的制备

转基因玉米（Zea mays）MON810及其受体由农业部科技发展中心提供。将MON810玉米与对应的非转基因玉米按质量比混合，制成MON810质量分数分别为10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%的样品。含有MON810玉米的转基因玉米混合物、不含有MON810玉米的转基因玉米混合物、转基因大豆混合物、转基因水稻混合物、转基因棉花混合物和转基因油菜混合物等转基因试验材料的混合样品由农业部科技发展中心委托农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（长春）制备（每种转化体质量百分含量为1%），具体转化体组分见表1。非转基因玉米（阴性对照）由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 转基因玉米MON810外源基因插入位点旁侧序列的获得及其引物设计 在GMO检测方法数据库（Detection method Database，GMDD）（http：//gmdd.shgmo.org/sequence/view/12）中查到MON810的旁侧序列信息，在其3′端旁侧的cry1Ab序列部分设计上游引物MON810-F：5′-ACCTCGAGATTTAC

CTGATCCG-3′，在玉米基因组的位置设计下游引物MON810-R：5′-TGCTGCAGGTGGTCTTACATC-3′。

1.2.2 特异性测试 特异性测试样品见表1。以质量百分含量为1%的MON810玉米为阳性对照，非转基因玉米为阴性对照，同时设置空白对照。样品基因组DNA的抽提采用CTAB方法[14]，提取的DNA用NanoDrop2000C（Thermo scientific）型核酸测定仪检测DNA的浓度和纯度，DNA浓度调整到25 ng/μL后用于PCR检测[14]。PCR 反应体系为10×Buffer 5.0 μL， dNTPs（10 mmol/L each）0.5 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL，上下游引物终浓度为0.4 μmol/L， 模板2.0 μL，总体积为25 μL；PCR扩增程序为： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 共35个循环；3次平行重复。

1.2.3 灵敏度测试 以质量分数分别为10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%的MON810样品的DNA作为PCR反应的模板，进行灵敏度测试，非转基因玉米为阴性对照，同时设置空白对照。样品基因组DNA的抽提、PCR反应体系和PCR扩增程序与1.2.2相同。

1.2.4 检出限的确定 为进一步确定方法的检出限，随机称取20份质量分数为0.1%的MON810玉米样品，提取基因组DNA，进行PCR扩增，每个样品设置3次平行PCR反应。非转基因玉米为阴性对照，同时设置空白对照。样品基因组DNA的抽提、PCR 反应体系和PCR扩增程序与1.2.2相同。

1.2.5 重演性验证 为验证建立抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法的重演性，在全国7家同行实验室对方法的检测特异性和灵敏度进行了测试。包括农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心（北京）、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（北京）、农业部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）、农业部农产品质量安全及转基因生物产品成分监督检验测试中心（杭州）、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（天津）、农业部转基因生物生态环境安全监督检验测试中心（天津）、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（长春）7家单位。验证样品如下：a：以质量分数为0.1%（以非转基因玉米为填充物）的MON810作为阳性对照；b：MON810玉米的受体作为阴性对照；c：特异性测试样品包括10个样品，包括以质量分数为1%的MON810玉米、质量分数为1%的Bt11玉米、质量分数为1% Bt176玉米、质量分数为1%的DAS-40278-9玉米、转基因玉米混合样品（MON863、 GA21、 NK603、 T25、 TC1507、 MON89034、 MON88017、 59122、 MIR604、 3272、 MON87460，混合制成1个样品，每个转化体质量分数为1%）、转基因大豆混合样品（356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12，混合制成1个样品，每个转化体质量分数为1%）、转基因水稻混合样品（KF-6、KMD-1、M12、KF-8，混合制成一个样品，每个转化体质量分数为1%）、转基因油菜混合样品（MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2，混合制成1个样品，每个转化体质量分数为1%）、转基因棉花混合样品（MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913，混合制成1个样品，每个转化体质量分数为1%）、非转基因玉米郑单958、吉单180、先玉335，等量混合制成1个样品；d：质量分数为0.1%的 MON810玉米作为灵敏度测试样品；e：以MON810玉米质量分数为5%的玉米面加工制作并蒸熟后的玉米馒头制成1个样品为加工样品的测试。

2 结果与分析

2.1 转基因玉米MON810外源基因插入位点旁侧序列分析

由图1可知，MON810分子信息显示表达载体的部分元件整合到玉米的基因组序列中，包括强启动子CaMV35S、玉米hsp70 内含子和cry1Ab；5′端上游部分有803 bp的玉米基因组序列，3′下游部分有588 bp的玉米基因组序列，全长为4 983 bp；并且在插入序列及其3′端的玉米基因组序列设计了定性PCR检测MON810玉米的上下游引物。

2.2 特异性测试

由图2可知，仅从MON810玉米和含有MON810的转基因玉米混合样品中扩增到预期的DNA条带，而在其他转基因玉米（Bt176、Bt11、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、59122、MIR604、MON88017、MON87460）、大豆（356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12、GTS40-3-2）、水稻（KF-6、KMD-1、M12、KF-8）、油菜（MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2）、棉花（MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913）混合样品中和非转基因玉米阴性对照样品中未扩增出预期条带的片段，上述结果表明建立的MON810玉米检测方法具有高度特异性。

2.3 灵敏度测试

由图3可知，在含量为0.1%以上（含0.1%）的MON810样品中均能稳定扩增到预期的DNA片段，表明建立的MON810玉米检测方法的灵敏度可达到0.1%。

2.4 检出限的确定

由图4可知，20份含量为0.1%的MON810试样中均能稳定检测出预期的DNA片段，表明本方法的检出限为0.1%。

2.5 重演性的验证结果

7家单位包括农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心（北京）、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（北京）、农业部谷物及制品质量监督检验测试中心（哈尔滨）、农业部农产品质量安全及转基因生物产品成分监督检验测试中心（杭州）、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心（天津）、农业部转基因生物生态环境安全监督检验测试中心（天津）、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（长春）（在表2 中分别用1～7数字表示）的复核验证结果见表2，仅从含有MON810转化体的样品（含加工品）中扩增获得预期的DNA片段，而在其他转基因玉米（Bt11、Bt176、DAS-40278-9、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460）、转基因大豆（356043、305423、CV127、MON89788、A5547-127、A2704-12）、转基因水稻（KF-6、KMD-1、M12、KF-8）、转基因油菜（MS1、 MS8、 RF1、 RF2、 RF3、 T45、 Oxy235、Topas19/2）、转基因棉花（MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913）和非转基因玉米阴性对照样品中未扩增获得预期片段。所有验证单位从含量为0.1%的MON810玉米样品中扩增获得预期片段，再次证明检测方法的灵敏度可达到0.1%，在加工品测试中，可从MON810玉米加工品馒头中扩增获得预期片段。

2.6 新方法与农业部869号公告-9-2007比较

新方法与农业部869号公告-9-2007相比见表3，引物设计的位置不同，新建立的方法引物设计的扩增区域为4 216～4 541 bp，扩增大小为325 bp，农业部869号公告-9-2007的引物设计的扩增区域为4 315～4 421 bp，扩增大小为106 bp，因而新建立的检测方法具有较好的特异性，不存在非特异性扩增现象。在同等实验条件下，不能检测出其他常见的转基因作物（包括转基因玉米、水稻、大豆、棉花和油菜），不会误判，不会引起争议。

3 讨论与结论

目前，转基因生物的安全性已经成为公众媒体舆论的焦点。为防范农业转基因生物的流散，农业部一再强调对转基因作物实施严格管理。孟山都公司研发的抗虫MON810玉米，由于能对抗玉米螟，因而受到广大种植户的欢迎。但MON810玉米的安全性一直是科学家及民众争论的焦点[3-6]。MON810玉米是获准进口到中国用作加工原料较早的一种转基因玉米品系。它在进口、加工或销售过程中可能存在流散，所以应该加强对该品系玉米的监管。建立MON810玉米品系特异性的检测方法和标准是对其监管的前提基础。

MON810自研发到应用以来，对MON810玉米品系特异性检测方法的研究一直没有停止，欧盟也已经建立了定量PCR检测方法，并且在几个实验室间已进行循环验证[15]。环介导的等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）也对MON810转化事件检测进行了报道。实时荧光定量PCR检测技术是对转基因产品成分含量进行标示的前提基础，而且这种检测技术成本较高，所需要的荧光定量PCR仪器设备并非所有的基层单位所能拥有，不适用于大规模的筛选检测。环介导的等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）是一种新兴技术，要发展为成熟常规的转基因成分检测的适用技术还需要很长时间。因此，目前定性PCR技术还是比较适用于转基因生物安全监管的技术之一。

本研究建立的MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法与曹际娟[1]相比，引物设计的位置不同，新建立的抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法的上游设计在抗虫基因cry1Ab序列上，下游引物设计在玉米的基因组序列，而曹际娟[1]的研究方法是上游引物设计在玉米基因组序列，下游引物在CaMV35S启动子的序列。这种方法也是目前检测MON810玉米转化体特异性的一种常用方法。新建立的方法扩增片段序列为抗虫基因cry1Ab部分序列与玉米基因组的部分序列，这种方法具有更好的特异性，对于抗虫玉米MON810的检测更具有针对性。与农业部869号公告-9-2007相比，新建立的方法引物设计区域有差异，扩增大小不同，新方法的扩增大小为325 bp，农业部869号公告-9-2007扩增大小为106 bp，因而新建立的检测方法具有较好的特异性，不存在非特异性扩增现象。同时，本研究建立的抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法具有良好的灵敏性，检出限达到0.1%，能够满足大宗混合样品检测的需要，这种方法也适用于对加工样品的测试。综上所述，本研究建立的抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法的特异性、灵敏度和重复性经过了全国7家同行实验室的验证。这是建立抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种的定性PCR检测方法的标准基础。利用该方法能准确鉴定出利用MON810作为亲本非法转育出的衍生品种，从而可防止MON810流散到环境中造成生态风险，因此能满足于对抗虫转基因玉米MON810及其衍生品种生物安全监管的需要。

参考文献

[1] 曹际娟， 曹远银. PCR对转基因玉米MON810的鉴定检测[J]. 玉米科学， 2003， 11（1）： 19-21.

[2] 覃 文， 曹际娟，朱水芳. 实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米MON810成分[J]. 食品科学， 2003， 24（8）： 132-134.

[3] Kuntz M， Davison J， Ricroch A E. What the French ban of Bt MON810 maize means for science-based risk assessment[J]. Nat Biotechnol， 2013， 31（6）： 498-500.

[4] Fernandes T J， Oliveira M B， Mafra I. Tracing transgenic maize as affected by breadmaking process and raw material for the production of a traditional maize bread， broa[J]. Food Chem， 2013， 138（1）： 687-692.

[5] Gu J， Krogdahl A， Sissener N H， et al. Effects of oral Bt-maize（MON810）exposure on growth and health parameters in normal and sensitised Atlantic salmon， Salmo salarL[J]. Br J Nutr， 2013， 109（8）： 1 408-1 423.

[6] James C. 2010年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. 中国生物工程杂志， 2014， 34（1）： 1-8.

[7] 苏 锐， 熊 嫣， 庆 宏，等. 转基因作物检测技术研究进展[J]. 化学通报， 2012， 75（2）： 121-125.

[8] 邓汉超， 尹长城， 刘果振，等. 转基因核酸成分检测技术研究进展[J]. 中国生物工程杂志， 2011， 31（1）： 86-95.

[9] 王小玉， 邝筱珊， 胡松楠， 等. LAMP实时浊度法快速检测转基因玉米MON810[J]. 现代食品科技， 2013， 29（12）： 3 002- 3 005.

[10] Rabiei M， Mehdizadeh M， Rastegar H， et al. Detection of genetically modified maize in processed foods sold commercially in iran by qualitative PCR[J]. Iran J Pharm Res， 2013， 12（1）： 25-30.

[11] Waminal N E， Ryu K H， Choi S H， et al. Randomly detected genetically modified（GM）maize（Zea mays L.）near a transport route revealed a fragile 45S rDNA phenotype[J]. PLoS One， 2013， 8（9）： e74 060. doi： 10.1371/journal.pone. 0074060. eCollection 2013.

[12] Moon G S， Shin W S. Establishment of quantitative analysis method for genetically modified maize using a reference plasmid and novel primers[J]. Prev Nutr Food Sci， 2012， 17（4）： 274-279.

[13] 农业部科技发展中心. 农业转基因生物安全标准（第1版）[S]. 北京： 中国农业出版社， 2012： 69-74.

[14] 农业部科技发展中心. 农业转基因生物安全标准（第1版）[S]. 北京： 中国农业出版社， 2012： 189-200.

[15] Takabatake R， Takashima K， Kurashima T， et al. Interlaboratory study of qualitative PCR methods for genetically modified maize events MON810， bt11， GA21， and CaMV P35S[J]. J AOAC Int， 2013， 96（2）： 346-352.

责任编辑：黄东杰