口腔材料细胞毒性评价方法的研究进展

石平 蒋均红

随着科学技术的进步，每年都有大量的口腔材料出现，而材料的生物相容性评价是确保材料能否用于人体的最重要因素，在细胞培养基础上的细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段目前已广泛应用于口腔材料的生物相容性评价。细胞毒性试验[1]是运用体外细胞培养技术检测医疗器械和（或）其浸提液可能造成的细胞生长抑制、细胞变异、细胞溶解、细胞死亡等影响细胞正常功能和生物学行为的作用。该实验是各种医疗器械临床应用前安全性评价的必选项目和重要指标，其特点是能在短期内检出供试品对细胞新陈代谢的影响，对毒性物质具有较大的敏感性，试验重复性好，可以减少不必要的动物体内实验。本文就细胞培养及两种细胞毒性的评价方法综述如下。

1 细胞培养的历史沿革

细胞生物学是生命科学的理论基础，也是现代生命科学的前沿科学，而细胞培养是其中的重要部分。细胞培养分为原代培养和传代培养[2]，目前细胞培养技术广泛应用于生物医学各个领域，是分子生物学和实验室生物技术等的核心实验室技术[3]。细胞培养始于20世纪初，1907年，Harrison利用悬滴法将分离自青蛙胚胎的神经细胞种植在青蛙的淋巴液中，首次在体外模拟了细胞的生长活动，为后来开展体外细胞研究开辟了新途径， Harrison也因此被誉为“细胞培养之父”[4]。1910年， Burrows在从Harrison实验室学习了这种技术以后尝试用鸡血浆代替淋巴液培养细胞并获成功。此后，Burrows与其外科医生出身的同事Alexis Carrel进一步致力于哺乳动物组织的培养技术研究。1912年，Alexis Carrel[4]将外科手术严格的无菌技术引入细胞培养并发明了专门的细胞培瓶（Carr-el flask，卡氏培养瓶），显著改良了Harrison所建立的培养技术并将其应用于成年组织细胞和肿瘤细胞的体外培养实践中，由于此研究成果的重大贡献，1912年，Alexis Carrel被授予诺贝尔医学与生理学奖，此后Alexis Carrel在体外成功培养了分离自鸡胚心脏的心肌细胞，并将其一直培养到了1946年，证明了体外细胞不但可以存活而且能传代增殖。1949年，Alan Parks发明了-196℃超低温冻存细胞的技术，成为细胞培养历史上又一次重大的技术进步。此后，抗生素和胰蛋白酶的出现，也极大地促进了细胞培养技术的发展。1952年，GO Gey[4]成功地培养了人类肿瘤组织并建立至今仍使用的HeLa细胞系，使细胞培养发展到人类组织培养阶段。20世纪80年代，以众多细胞系的建立为特点。现在细胞培养基本上渗透到到生命科学的各个领域，随着培养条件的改善，该技术也越来越容易掌握。

2 根据材料和细胞接触方式的细胞毒性评价方法

依据接触方式，目前常用的评价口腔医疗器械细胞毒性试验方法有以下三种[5]：琼脂扩散试验、滤膜扩散实验、直接接触实验。①琼脂扩散试验（间接接触试验）：适用于固体（包括粉末）和液体等试验材料的检测，通过琼脂糖扩散后来评价材料的非特异性细胞毒性；②滤膜扩散实验（间接接触试验）：适用于固体（包括粉末）和液体等试验材料的检测，通过乙酸纤维素滤膜扩散后评价材料的非特异性细胞毒性；③直接接触实验（包括浸提液试验）：该试验适用于评价固体材料和材料浸提液或液体材料的细胞毒性。

在应用直接接触试验时，体外培养的细胞，失去了身体神经体液的调节和细胞间相互作用的影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，而且其生长受营养条件、生长空间等因素的限制，所以，Hensten 等[6]认为，直接接触法所得的结果不能反映材料在口腔内实际的生物相容性，缺乏准确性。在间接接触试验中，琼脂扩散试验和滤膜扩散实验利用可溶性抗原与相应抗体特异性结合，从而来检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。Murray 等[7]研究表明在间接接触试验中，琼脂或者滤膜作为屏障用于模拟口腔黏膜，能较为真实地反映口腔的环境，但琼脂类材料和牙本质的渗透性还是有很大的区别[8]，故而间接接触试验不能有效地反映牙本质情况，目前的标准体外细胞毒性试验存在一些不足之处，主要原因是试验细胞与试验材料之间没有牙本质屏障[9]。近年来，国内陈志军等[10]利用人工羟基磷灰石陶瓷片模拟牙本质，从而确保牙本质通透性的可控性，为口腔材料体外细胞毒性试验提供了一个高效可靠的评价方法。

3 生物学终点评价细胞毒性的评价形式

生物学终点评价形式包括以下五种：

3.1细胞形态学评价：主要是观察细胞的形态变化，该方法是最早用于检测细胞损伤的方法，通过在显微镜下观察细胞形态的改变，可以判断细胞是否有污染、是否健康以及增殖情况。在显微镜下，通过观察裂解细胞所占的比例来评估细胞毒性级别，Sujata等[11]研究得出细胞形态学評价方法与MTT法等定量细胞毒性法的Perason相关系数为0.9，表明两者具有良好的相关性。目前，该方法仍广泛用于生物材料细胞毒性的评价。

3.2细胞膜性效应评价：主要是从细胞膜的通透性改变方面来鉴别存活细胞与死亡细胞，包括以下两种试验方法。

3.2.1中性红摄取试验（NRU）：1986年，Borenfreund等[12]建立中性红摄取试验，并对多种材料细胞毒性进行评价，表明该试验是快速评价细胞毒性的方法。国际标准ISO已收录该检测方法，经济合作与发展组织（OECD）也于2010年将该方法列为细胞毒性试验预测急性经口毒性试验起始剂量的指导性文件[13]。

3.2.2乳酸脱氢酶释放法（LDH 释放法）：乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内酶之一，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至细胞外，所以培养基中该酶活性与被裂解的细胞数量成正比，采用全自动生化分析仪直接检测细胞培养板上清液中LDH，可以反映细胞损伤程度。此方法操作简便，灵敏度高，用LDH释放法检测肿瘤患者CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）活力，有助于CIK疗法适应患者的选择及个体疗效观察[14]。

3.3細胞代谢活性评价：该方法是通过检测细胞生物代谢或生物合成功能的改变来了解细胞损伤作用，当前，以活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法可以灵敏地反映材料对细胞的损害程度[15]。主要包括MTT实验和XTT实验。

3.3.1 MTT试验：MTT试验以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthia-hiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础，通过MTT噻唑蓝作用于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，生成非水溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，且MTT结晶形成的量与细胞数成正比。目前该试验作为材料细胞毒性评价方法，实验步骤规范标准化，结果准确，简便快速[16-17]，但是在试验过程的结晶产物，需要用二甲基亚矾（DMSO）溶解后才能测定光吸收值，若是溶解不充分，会影响测定结果，从而使得MTT灵敏度略差，因此，杨晓冉等[18]建议MTT法和中性红摄取试验（NRU）联合使用。

3.3.2 XTT试验：XTT试验在MTT的基础上，省去溶解还原产物结晶的步骤，1988年，Scudiero等[19]首次采用该方法检测细胞增殖。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。该试验方法较MTT 法具有显著优点，已被纳入国际标准ISO10993-5：2009中，但XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用，成本较高。

3.4细胞增殖率评价：主要是观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞生长速度和增殖的变化，主要有克隆形成试验。最早由Tuchiya提出，用克隆形成率（实验组克隆数/对照组克隆数）来评价材料的细胞毒性。Tuchiya等[20]研究表明，克隆形成试验较分子滤过法、琼脂覆盖法、中性红摄取法更为敏感，目前该方法已收录在国际标准ISO 10993-5：2009中。

3.5 DNA合成率检测评价：通过测定有丝分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力，主要有5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）渗入法和胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法。敏感性很高，但重复性略差[21]。

综上所述，评价材料的体细胞毒性的试验方法较多，而由于不同材料接触方式及毒理不一，各试验方法之间又存在很大的敏感差异。因此，Weyermann等[22]提倡在选择试验方法时，必须根据“最接近应用状况”的原则，合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价方法。

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[收稿日期]2014-05-26 [修回日期]2014-06-19

编辑/李阳利