北京市售生鲜猪肉和牛肉中有害细菌的鉴定及耐药性分析

秦宇轩 李晶 朱宝利 律娜 辛建桥 金禄懿

摘 要：采用选择性培养基初步筛选，结合16S rRNA同源性分析的方法，对北京市农贸市场及超市中所销售的生鲜猪、牛肉中含有的有害细菌的分布情况进行考察。对分离得到的细菌针对7种常见抗生素进行耐药表型检测。同时，利用特异性PCR扩增法检测了2个常见红霉素耐药基因和7个常见四环素耐药基因在分离细菌中的分布情况。结果表明：市场中购买的生鲜肉中分离得到的细菌耐药情况较之超市中的更为严重；猪肉和牛肉中分离的细菌耐药情况均十分严重；分离得到的不同细菌中包含某些条件致病菌的Escherichia/Shigella以及Aeromonas属细菌耐药情况更加严重。同时，研究还发现在北京市售鲜肉中分离得到的细菌中，绝大多数细菌对不止1种抗生素表现出非敏感（耐药及中介），且一些菌株携带多种不同的耐药基因。因此，市售生鲜肉中分离得到的细菌耐药情况较为严重以及普遍，应得到监管部门以及普通消费者的足够重视。

关键词：生鲜肉；致病菌；鉴定；耐药表型；耐药基因

Identification and Drug Resistance Analysis of Pathogens in Retail Pork and Beef from Beijing

QIN Yu-xuan1, LI Jing2, ZHU Bao-li2, LÜ Na2,*, XIN Jian-qiao3, JIN Lu-yi4,

(1. College of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China;

2. Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;

3. Beijing No.80 High School, Beijing 100020, China;

4. School of Life Sciences, Capital Normal University, Beijing 100048, China)

Abstract: Distribution of pathogens in retail pork and beef from Beijing supermarkets and markets were investigated by selective culture and 16S rRNA sequencing. The antibiotic resistant phenotypes of all the isolates were detected, including 7 common antibiotics. Meanwhile, two common erythromycin resistance genes and seven common tetracycline genes were detected among all the isolates. The results showed that the drug resistance of bacteria isolated from meat samples collected from markets was more serious; both the isolates from pork and beef showed serious drug resistance; among all the isolated bacteria, Escherichia/Shigella and Aeromonas genus, which contained some opportunistic pathogen species, showed the most serious drug resistance. Meanwhile, we also found that the majority of the isolates were non-susceptible (resistant and intermediate) to several kinds of antibiotic, and some of the isolates carried more than one antibiotic resistance genes (ARGs). The above evidence showed that drug resistance was common and serious among bacteria isolated from commercial meats. Both regulators and consumers should pay more attention to it.

Key words: meats; pathogen; identification; antibiotic resistance phenotype; antibiotic resistance gene

中图分类号：TS207.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）02-0016-06

近年来随着我国国民生活水平的日益提高，广大消费者对生鲜肉类，尤其是生鲜猪、牛肉的需求也随之增加。目前，我国已经成为世界养猪大国，生猪出栏量、猪肉产量均位居世界第一[1]，牛肉的消费量也十分巨大。与此同时，由于食用猪、牛肉及其相关制品所导致的食物中毒以及传染病的发病率也呈现出逐年上升的趋势。食物中毒及传染病的发生主要是由生鲜猪、牛肉中所含有害细菌导致的，而主要的有害细菌包括大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）等[2-6]。上述细菌进入人体后所产生的有毒有害物质会对人们身体健康产生严重影响，甚至危及生命。

抗生素是20世纪人类最伟大的发明之一，它在治疗感染性疾病方面有着不可替代的作用。但近半个世纪以来抗生素的使用范围不断扩大，已经不再局限于医疗卫生和兽医方面，在养殖业和食品加工业的用量也有逐年上升的趋势，尤其在畜禽养殖行业中最为严重，我国每年抗生素原料生产量约为21万吨，其中9.7万吨（占年总产量46.1%）用于畜牧养殖业[7]。抗生素的大量使用所带来的选择性压力必然加速细菌对某种抗生素，甚至多种抗生素的耐药进程。耐药细菌尤其是超级细菌（如携带有NDM-1基因的细菌）已经成为人们在应对细菌感染疾病时的巨大挑战[8]。如果携带有耐药基因（antibiotic resistance genes，ARGs）的，对抗生素非敏感（包括耐药菌株和中介菌株）的细菌进入人体，致病菌可能导致某种或几种甚至是所有常用抗生素在治疗时失去疗效，普通的环境细菌还可以将所携带的耐药基因传递给人体内其他的致病菌或者条件致病菌，使它们均产生耐药性，对人类健康造成极大威胁[9]。细菌耐药问题对人们身体健康所带来的危害日趋严重。动物肠道中的有害菌以及耐药细菌可能经屠宰加工过程进入到鲜肉及其制品当中，同时很有可能借助此环节传播至人类体内，对人们身体健康甚至是生命安全带来威胁。

本实验旨在检测北京市售生鲜猪、牛肉中常见有害微生物，同时对其耐药表型以及所携带耐药基因的情况进行检测，为市售生鲜猪、牛肉的安全评价体系提供有效参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

处于产品保质期内的生鲜猪、牛肉样品共8份 市售。

药敏检测纸片 英国Oxoid公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；2×PCR扩增预混和溶液（含有Mg2+） 宝生物工程（大连）有限公司；实验所需引物均由上海生工生物工程有限公司北京合成部合成。

1.2 仪器与设备

微量移液器 法国Gilson公司；Z216 MK型离心机型 德国Hermle公司；HPX-9272 MBX型恒温培养箱 上海博迅公司；ND1000型微量核酸定量仪 美国NanoDrop公司；2720型PCR仪 美国Applied Biosystems公司；Powerpac基础型电泳仪 美国Bio-Rad公司；AlphaImager EP型凝胶成像系统 美国Alpha Innotech公司等。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离及菌落计数

编号生鲜猪肉或肉馅样品为P1、P2、P3、P4；生鲜牛肉样品为B1、B2、B3、B4。把从市场或超市中收集到的每一份生鲜肉样本取一部分放入沸水中处理3 min进行表面灭菌，用无菌刀去掉鲜肉的表层，取中间的红色鲜肉部分切成碎末，称取12.5 g切碎的鲜肉放入50 mL离心管中，标记为“肉内”；样本剩余部分用无菌刀取表面鲜肉部分并切成碎末，称取12.5 g切碎的鲜肉放入50 mL离心管中，标记为“肉外”；称取从同一地点购买的肉馅12.5 g放入50 mL离心管中，标记为“肉馅”，以上操作均在超净工作台中进行。

向装有上述鲜肉样品的离心管中加入50 mL生理盐水致，至于振荡器上缓慢振荡，置于试管架上静置1 h，待样品自然沉淀后，取100 μL或50 μL上清液分别涂布于普通LB固体培养基、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌选择性固体培养基上，37 ℃培养过夜，用于样品的菌落计数以及有害细菌的初步分离与筛选，实验方法参照GB 4789.2—94《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》进行[10]。根据选择培养结果，每种鲜肉样本上的3种选择性培养基平板上随机挑选3～5个单菌落，编号EP(B)1-1、EP(B)1-2……EP(B)1-5；SMP(B)1-1、SMP(B)1-2……SMP(B)1-5；SAP(B)1-1、SAP(B)1-2……SAP(B)1-5。其中“E、SM、SA”分别代表大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌选择性培养基上筛选出来的菌株；“P、B”分别代表猪肉及其肉馅和牛肉及其肉馅中筛选出来的菌株。其余样本均以此命名方法类推，接种于4 mL LB液体培养基中37 ℃富集培养过夜备用。富集培养出的菌株用于菌种的保藏、基因组DNA的提取和菌种的耐药表型实验。

1.3.2 菌种基因组DNA的提取

依据细菌基因组DNA提取试剂盒的使用说明对所有富集培养后的菌种进行基因组DNA的提取，提取结果用1%琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色后通过凝胶成像系统进行检测，并用微量核酸定量仪进行浓度测定。

1.3.3 16S rRNA测序

挑选出来的所有111株菌种用27F:（5-AGAGTT

GATCMTGGCTCAG-3）和1492R:（5-TACGG

YTACCTTGTTACGACTT-3）[11]引物进行16S rRNA的PCR扩增。PCR扩增体系（30μL）：50～100ng模板DNA，上下游引物各0.1μmoL，2×PCR扩增预混和溶液（含有Mg2+）15μL，补足双蒸水至30μL。反应条件为94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，35个循环；72 ℃、10 min[11]。PCR 产物用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳，经EB染色后检测是否扩增成功，结果呈阳性的样本送华大基因组中心有限公司，用相同的引物进行双向测序。测序结果经拼接后在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库中进行BLAST比对，如果所测序列与已知序列一致性大于97%就认为所测序列为该种细菌[12]。

1.3.4 菌株耐药表型分析

分离得到的111株细菌经富集培养后，吸取100 μL菌液涂布于固体LB培养基上，取7种不同类型的药敏检测纸片：土霉素（四环素类，30 μg）、万古霉素（糖肽类，30 μg）、头孢氨苄（β-内酰胺类，30 μg）、庆大霉素（氨基糖苷类，10 μg）、四环素（四环素类，30 μg）、链霉素（氨基糖苷类，10 μg）以及红霉素（大环内脂类，5 μg），放置于涂布完成的平板上，37 ℃培养过夜，测量平板上抑菌圈的直径，结果参照美国临床实验室标准委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）关于纸片扩散法的判读标准进行判断[13]。

1.3.5 菌株耐药基因扩增

表 1 耐药基因扩增引物及退火温度

Table 1 Primers and PCR conditions for selected antibiotic resistance genes

引物 引物序列（5→3） 退火温度/℃ 目的片段长度/bp

erm A F:AAGCGGTAAACCCCTCTGA 55 190[14]

R:TTCGCAAATCCCTTCTCAAC

erm B F:GAAAAGRTACTCAACCAAATA 52 642[15]

R:AGTAACGGTACTTAAATTGTTTAC

tet M F:GTTAAATAGTGTTCTTGGAG 55 576[16]

R:CTAAGATATGGCTCTAACAA

tet K F:TTAGGTGAAGGGTTAGGTCC 55 697[16]

R:GCAAACTCATTCCAGAAGCA

tet L F:CATTTGGTCTTATTGGATCG 50 456[16]

R:ATTACACTTCCGATTTCGG

tet S F:ATCAAGATATTAAGGAC 56 573[17]

R:TTCTCTATGTGGTAATC

tet O F:AACTTAGGCATTCTGGCTCAC 52 515[17]

R:TCCCACTGTTCCATATCGTCA

tet Q F:AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG 56 169[17]

R: CGGAGTGTCAATGATATTGCA

tet W F:GAGAGCCTGCTATATGCCAGC 64 168[18]

R:GGGCGTATCCACAATGTTAAC

因红霉素和四环素是饲料行业使用非常广泛的2种抗生素。现有报道显示，人体肠道耐药基因的种类及丰度与临床用抗生素种类关系不明显，反而与兽用抗生素的使用存在着一定的关联性[12]。故本研究对市售生鲜猪、牛肉中分离得到的细菌进行了常见红霉素以及四环素耐药基因的检测，包括2个红霉素抗性基因（erm A、erm B）以及7个四环素抗性基因（tet M、tet L、tet O、tet Q、tet S、tet W、tet K）[14-18]，上述不同基因的引物序列以见表1。PCR反应体系（30 μL）：上下游引物各0.1 μmoL，2×PCR mix（dNTPs、Mg2+、PCR缓冲液以及Taq DNA聚合酶）15μL，50～100 μg DNA 模板，补足双蒸水到20 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，72 ℃ 延伸60 s，退火30 s（不同基因退火温度见表1），共40个循环；72 ℃ 延伸10 min[13,16]。PCR产物用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳，经EB染色后通过凝胶成像系统进行检测。为了确认PCR产物为耐药基因，阳性结果送北京华大基因公司用相同的引物进行测序确认。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离计数与DNA提取

如表2所示，不同鲜肉样品不同部位的菌落计数结果显示：所有样品内部的细菌数量均少于10 CFU/g；样品表面即肉外的细菌数量从40 CFU/g到满板，不同样品肉外的细菌的数量差别较大；肉馅样品中的细菌含量最少也达到了200 CFU/g，多数肉馅样品中的细菌数量多至无法准确计数。同时研究还发现来自超市中生鲜肉（B3、P3）所带的细菌数量远小于市场上收集的生鲜肉（B4、P4）所携带的细菌数，如肉内的细菌数目超市中的鲜肉为0～1.04 CFU/g，而市场样品为6.4（P4）和9.6（B4）。

用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌选择性培养基对8份市售生鲜肉样品中的细菌进行初步分离、培养，按照目的细菌的挑选原则，随机挑选出大肠杆菌，金黄色葡萄球菌株，沙门氏菌各40株，合计120株进行扩大培养。经过扩大培养，共得到111份扩增培养后的菌液。琼脂糖凝胶电泳结果显示，111株细菌均成功提取了基因组DNA。

表 2 不同样品菌落计数结果

Table 2 Results of colony counting for different samples

样品编号 部位 数量/(CFU/g) 样品编号 部位 数量/(CFU/g)

B1 内 0.08 P1 内 1.04

外 40 外 68

馅 — 馅 —

B2 内 0 P2 内 0.4

外 16 外 160

馅 — 馅 240

B3 内 0 P3 内 0.24

外 144 外 176

馅 200 馅 280

B4 内 9.6 P4 内 6.4

外 — 外 —

馅 — 馅 —

注：“—”表示该部位固体培养基上的菌落数过多无法准确计数。

菌落计数结果显示，样品内部的细菌含量极少，样品表面的细菌含量较之肉内细菌含量增加很多，肉馅中细菌含量最多，多数肉馅样品中细菌的含量用肉外样本同样的方法已经无法准确计数。肉内几乎不接触环境细菌，肉表面暴露在运输及销售环境中，而肉馅要接触绞肉机，同等质量下肉馅与环境接触的面积最大。因此推测生鲜肉及肉馅中的细菌来自环境，包括屠宰、运输及销售环境。

2.2 16S rRNA序列分析

成功获得的111株细菌基因组DNA用16S rRNA引物进行PCR扩增、测序。同源性分析的结果显示33株分离自大肠杆菌选择性培养基的细菌全部属于Escherichia/Shigella属；40株分离自金黄色葡萄球菌的显色培养基的细菌中32株属于Macrococcus属、5株属于Staphylococcus属、3株属于Aeromonas属；38株分离自沙门氏菌选择培养基的细菌中有31株属于Aeromonas属、6株属于Enterobacter属、1株属于Kluyvera属。

16S rRNA序列分析结果表明，除大肠杆菌选择性培养基上分离出的细菌属于Escherichia/Shigella属外，金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌选择性培养基上培养出的细菌经鉴定均不是上述2种细菌。根据培养基说明书并结合实验结果，在某种相似细菌居多、目的细菌过少的情况选择性培养基的假阳性率增加。所以有关细菌的分离鉴定，需要在显色培养的基础上增加生理生化分析或分子生物学的方法进行进一步的鉴定。

2.3 分离菌株的耐药表型检测结果

由表3所示，菌株对四环素、红霉素、恩诺沙星以及万古霉素的耐药更严重，有100株（90.1%）对四环素非敏感；109株（98.1%）对红霉非敏感；94株（84.7%）对恩诺沙星表现为非敏感；96株（86.5%）对万古霉素非敏感。菌株对其他抗生素的耐药情况也不可忽视，有52株对庆大霉素非敏感；75株对头孢氨苄非敏感；71株对链霉素非敏感，非敏感率分别为46.8%、67.6%以及64.0%。除对庆大霉素的非敏感率低于50%，菌株对其余抗生素非敏感率均在60%以上。

表 3 分离菌株的耐药性分布

Table 3 Distribution of antibiotic resistance phenotypes

抗生素类型 名称 敏感 非敏感

耐药 中介 总数

数量 百分比/% 数量 百分比/% 数量 百分比/% 数量 百分比/%

四环素类 四环素 11 9.9 100 90.1 0 0.0 100 90.1

氨基糖苷类 庆大霉素 59 53.2 33 29.7 19 17.1 52 46.8

链霉素 40 36.0 55 49.5 16 14.4 71 64.0

β-内酰胺类 头孢氨苄 36 32.4 43 38.7 32 28.8 75 67.6

糖肽类 万古霉素 15 13.5 88 79.3 8 7.2 96 86.5

氟奎诺酮类 恩诺沙星 17 15.3 55 49.5 39 35.1 94 84.7

大环内酯类 红霉素 2 1.8 92 82.9 17 15.3 109 98.2

2.3.1 不同来源鲜肉中菌株的耐药表型检测结果

在培养成功的111株细菌中，其中有83株分离自北京大型超市中销售的生鲜肉；28株分离自北京农贸市场中销售的鲜肉。分离自市场鲜肉中的细菌有26株（92.6%）对5种及以上的抗生素表现为非敏感，有5株（17.9%）对所检测的7种抗生素表现为非敏感；分离自超市中出售的鲜肉中的细菌，其中54株（65.1%）对5种及以上的抗生素非敏感，27株（32.5%）表现为全部非敏感（图1）。

2.3.2 不同种类鲜肉中菌株的耐药表型检测结果

本实验所分离并成功培养的111株细菌中，其中有53株分离自猪肉及肉馅；有58株分离自牛肉及肉馅。其中分离自猪肉的菌株中有37株（69.8%）对5种及以上的抗生素非敏感，有17株（32.1%）对实验用7种抗生素全部非敏感。分离自牛肉的细菌有45株（77.6%）对5种及以上的抗生素非敏感，有7株（12.1%）菌对实验用的7种抗生素变现为全部非敏感（图1）。

图 1 不同来源及种类鲜肉中分离得到细菌的耐药表型

Fig.1 Antibiotic resistance phenotype of bacteria from beef and pork from different commercial sources

耐药表型结果显示，目前生鲜肉中分离得到的细菌对常见抗生素耐药十分严重且分布广泛。实验分离得到的111株细菌除庆大霉素以外，对其他6种抗生素的非敏感率均达到了50%以上。对四环素及红霉素的非敏感率甚至达到了90%以上，而四环素和红霉素也正是兽医的常用抗生素。抗生素在养殖业中的用途广泛，除去治疗感染性疾病以外，还可以用于常规的预防性治疗、养殖厂的消毒、甚至用于促进牲畜的生长。这种常年的、较低浓度的抗生素使用状态，势必会导致较高的选择性压力[19]，促进细菌的耐药进程。

实验发现，市场样品中分离的细菌对5种及5种以上抗生素的耐药率要高于超市样品，说明市场环境中的细菌无论是耐药表型还是耐药基因的数目都要高于超市中的细菌。这样的结果可能与市场环境复杂、消毒措施简陋、对销售人员管理不严有一定的关系。但是，本实验发现在某个超市样品（无论是猪肉还是牛肉）中分离的Escherichia属细菌对7种抗生素全部耐药。推测这可能是由于一株或几株高耐药的Escherichia污染所造成的。虽然超市的生鲜区销售环境较之市场要相对整洁，但是由于处于半密闭的环境，造成单个或少数耐药细菌大面积污染的几率比市场更高。因此，无论是超市还是市场都应该严格控制生鲜区的卫生状况，相关监管部门也应加强日常的监督和管理。

2.4 耐药基因扩增结果

2.4.1 不同耐药基因的分布情况

在111株培养成功的菌株中，83个菌株中检测到115个耐药基因，检出率高达74.8%，其中检测到2个erm B基因、16个tet K基因、4个tet M基因、57个tet O基因、36个tet L基因，没有检测到erm B、tet S、tet Q以及tet W基因。有11株（9.6%）菌同时携带3个不同的耐药基因，8株（7.0%）菌同时携带2个不同的耐药基因（图2）。随机挑选了50个PCR产物进行测序，所有扩增产物均为目的耐药基因。

图 2 不同耐药基因分布情况

Fig.2 Distribution of different kinds of ARGs

2.4.2 不同来源鲜肉中菌株的耐药基因分布情况

在超市购买的鲜肉中分离得到83株细菌，其中有54株菌检测到66个耐药基因，红霉素耐药基因1个；四环素耐药基因65个。携带2个及2个以上耐药基因的菌株有9株占总数10.8%。市场中购买的鲜肉中分离得到28株细菌，检测到1个红霉素耐药基因，45个四环素耐药基因，分别属于27株细菌；携带2种及2种以上耐药基因的菌株有10株，占总数35.7%（图3）。

2.4.3 不同种类鲜肉中菌株的耐药基因分布情况

图 3 不同来源及种类鲜肉中分离得到细菌的耐药基因分布

Fig.3 Distribution of ARGs among bacteria from different commercial sources and species of meat

从猪肉中分离得到的细菌共检测到53株含有56个耐药基因，至少携带一种耐药基因的菌株有37株，检出率为69.8%；携带2种及2种以上耐药基因的菌株有12，占总数22.6%；牛肉中分离得到的58株细菌的检出率则为77.5%，包括1个红霉素耐药基因、55个四环素耐药基因，携带2种及2种以上耐药基因的菌株有7株，占总数12.1%（图3）。

市场样品中分离的细菌携带1个或多个耐药基因的比例均高于超市样品，这与市场环境开放及卫生条件较差也存在较大关系。本实验检测的9种耐药基因中，四环素耐药基因tet O检出率最高，其次是tet L、tet K以及tet M，其中多数tet O基因来自Aeromonas以及Escherichia菌属，它们均属于Enterobacteriaceae科，多数该科细菌是动物以及人类肠道中常见种类，而肠道内以及环境中四环素耐药基因又有很高的丰度[20]。因此，推断从鲜肉中分离的携带tet O基因的细菌可能来自屠宰或加工过程中粪便中细菌的污染；tet L、tet K以及tet M基因多来自Macrococcus属细菌，且实验发现其对四环素普遍耐受。因该属多分离自牛肉、牛奶及动物皮肤表面，推测其耐药性及耐药基因可能来自于牲畜的饲养过程。虽然，实验分离的所有111株细菌对红霉素的耐药率高达98.2%，但仅有2株细菌检测到了红霉素erm B基因。现在已知的红霉素及其所属的大环内酯类抗生素相关耐药基因有几十种，所以，本实验推测鲜肉中所分离得到的对红霉素耐药的细菌中含有erm A和erm B以外的针对红霉素的耐药基因。

3 结 论

随着抗生素在猪、牛等养殖业中的大量使用，生鲜猪、牛肉中分离得到的细菌的耐药情况也日益严重[21]。同时，生鲜肉及其肉馅等制品中有害细菌的存在对消费者的健康有着极大的威胁。虽然，目前市售生鲜肉中分离细菌的耐药情况较为严重，但作为消费者如果在食用鲜肉之前将其充分加热，就能很好的杀灭其中的细菌，这样就可以减少有害细菌以及耐药细菌对消费者身体健康带来的影响。同时，饲养行业应严格控制以及规范使用抗生素，降低抗生素对耐药细菌的选择性压力。相关部门还应加强对生鲜肉品商场卫生环境的监管，对市售生鲜肉中细菌的耐药性进行监测。不仅是耐药表型，同时更应重视耐药基因的监管力度，从根本上维护广大消费者的权益。

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