自然发酵豆豉曲中产AMP脱氨酶菌株的筛选及其产酶条件研究

饶胜其 曾化伟 方维明

摘要

[目的]筛选能高产AMP脱氨酶的野生菌株，并对该菌株进行菌种鉴定和发酵条件优化。[方法] 通过大豆的自然发酵制备豆豉曲，并分别以PDA、MRS和YPD 3种培养基进行豆豉曲中微生物的分离纯化，将获得的分离菌株进行液体发酵培养，并检测发酵液的AMP脱氨酶活力。[结果]试验通过3种培养基分离纯化，获得纯种菌株51株。通过进一步的摇瓶发酵培养，检测到具有AMP脱氨酶活性的菌株为16株，选取活性最高的DCP23菌株进行菌落形态和菌丝形态分析，初步鉴定该菌株为青霉菌属。通过摇瓶发酵条件优化，确定该菌株产酶的适宜发酵条件为：培养基初始pH 为6.0，接种量为6%，30 ℃发酵60 h。在上述发酵条件下，发酵液中的AMP脱氨酶可达到293.7 U/ml。[结论]试验获取了1株能产较高活性AMP脱氨酶的野生青霉菌株DCP23，可为高产AMP脱氨酶的菌株研究提供参考。

关键词 AMP脱氨酶；自然发酵；豆豉曲；菌株筛选

中图分类号 S609.9 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）27-09532-05

Study on Screening and Incubation Condition of AMP DeaminaseProducing Strains in Douchiqu from Soybeans Natural Fermentation

RAO Shengqi¹， ZENG Huawei²， FANG Weiming1*

（1. School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127； 2. Jiangsu Alphay BioTechnology Co. Ltd.， Nantong， Jiangsu 226009）

Abstract [Objective] To screen out wild strains for producing AMP deaminase， the strain identification and fermentation conditions optimization were conducted. [Method] Through natural fermentation of soybean to prepare Douchiqu， three culture mediums PDA， MRS and YPD were used to conduct separation and purification of microorganism in Douchiqu. The liquid fermentation culture was conducted on the obtained isolated strains， and the AMP deaminase activity was detected. [Result] The strains from Douchiqu were purified respectively with PDA， MRS and YPD medium， and then 51 pure strains in total were obtained. Through further fermentation culture with shake flask， 16 strains among them with AMP deaminase activities were detected. The colony morphology and mycelium morphology analysis of DCP23 with the highest activity were conducted， and this strain was preliminary identified as penicillium. Through optimization of fermentation condition， the suitable condition for enzyme production was as followed： initial pH value of 6.0， inoculation amount of 6%， fermentation of 60 h at 30 ℃. Under the above conditions， the AMP deaminase activity in the fermentation broth could reach 293.7 U/ml. [Conclusion] DCP23 was obtained， which can provide reference for study on strains producing high yield of AMP deaminase.

Key words AMP deaminase； Natural fermentation； Douchiqu； Strain screening

腺苷酸脱氨酶（AMP deaminase ，EC 3.5.4.6）是氨基水解酶的一种，它能够定量脱去腺苷酸嘌呤碱基上的氨基，生成肌苷酸IMP 和NH₃^[1]。AMP 脱氨酶是构成嘌呤核苷酸代谢循环的3种主要酶类之一，它对维持体内腺苷酸能荷和机体免疫力有重要作用^[2-3]。AMP脱氨酶最大用途是酶解腺苷酸生成IMP用于生产强力味精，它还是核酸酶解法生产呈味核苷酸的重要酶类之一。此外，AMP脱氨酶还可用于生产细胞的H+缓冲剂^[4-5]。目前，AMP脱氨酶主要采用动物组织抽提法和微生物发酵法进行制备。直接提取法生产成本较高，不适合于工业化大生产，但可用于科研^[6-7]。现在工业生产中使用的酶大都由酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物发酵制备，国内已有通过微生物发酵产AMP脱氨酶的报道[5，8-10 ]。采用微生物发酵法生产AMP 脱氨酶，操作简便，易于工业放大，生产成本低，可作为AMP脱氨酶生产的主要途径。但是，目前用于制备AMP脱氨酶的菌株资源有限，因此非常有必要从自然界筛选能高产AMP 脱氨酶的野生菌株及其基因资源。

豆豉，是我国传统发酵食品，在制曲过程中，豆豉曲表面会集聚丰富的微生物，有乳酸菌、酵母菌和霉菌^[11-12]。笔者依据自然发酵豆豉曲中富集的主要微生物，采用3种固体培养基（YPD、PDA、MRS）对豆豉曲中的野生菌株进行分离纯化，将获得的分离菌株进行液体发酵培养，并检测发酵液的AMP脱氨酶活力，以筛选能高产AMP脱氨酶的野生菌株，并对该菌株进行菌种鉴定和发酵条件优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与培养基。试验菌株均从自然发酵豆豉曲中筛选得到。

PDA液体培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml，121 ℃灭菌20 min。

MRS液体培养基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，K₂HPO₄2 g，柠檬酸氢二铵2 g，乙酸钠5 g，吐温80 1 ml，MgSO₄·7H₂O 0.58 g，MnSO₄0.25 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 ml，调节pH至62～6.4，121 ℃灭菌20 min。

YPD液体培养基：蛋白胨20 g，酵母浸膏10 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 ml，调节pH至50～5.5，121 ℃灭菌20 min。PDA固体培养基、MRS固体培养基和YPD固体培养基均为在各自液体培养基配方基础上各加20 g琼脂而制成。

1.1.2 主要试剂与设备。

主要试剂：除腺苷酸AMP为sigma公司外，其余试剂均为国产分析纯。主要仪器：DH2C大容量恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂；UV7504紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；pico17微量台式离心机，美国Thermo公司；5804R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；SX500高压蒸汽灭菌锅，日本TOMMY公司；DGX 9053B2 生化培养箱，上海福玛试验设备有限公司；ZHJH C1209B垂直流超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 自然发酵豆豉曲的制备。

将500 g黄豆经过清洗、沥干、蒸煮、冷却和自然接种后，于室温（约25～30 ℃）自然发酵，48 h后进行翻曲，放置5 d左右即可得到菌丝密度的豆曲，此时的豆豉曲即可用于筛选菌株。

1.2.2 产AMP脱氨酶菌株的筛选。

1.2.2.1 菌样获取。从豆豉曲上选取微生物菌落特征差别较大的多个点，分别称取样品2 g加入装有90 ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，室温振荡30 min使样品充分打散，静置获得样品悬液。

1.2.2.2 菌株分离。样品悬液梯度稀释后均匀涂布于初筛平板YPD、PDA和MRS上，30 ℃恒温培养48 h后，选择涂布浓度适宜的平板，以菌落生长分开，形态完整为宜，从平板中挑取生长单独的菌落分别进行划线，培养，重复划线培养操作至少3次。对于YPD平板上的特征菌株，也可以针对性地用PDA和MRS平板进行选择性划线分离，其他平板类似。最终从各自筛选平板上得到纯种的菌株。

1.2.2.3 摇瓶培养。将YPD、PDA和MRS平板上分离得到的纯种菌株分别采用相应液体培养基进行摇瓶培养，250 ml三角瓶装液50 ml。将MRS平板上分离得到的纯种菌株进行活化后，按体积分数2%接种于新鲜MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养 50 h；将YPD平板上分离得到的纯种菌株进行活化后，按体积分数2%接种于YPD液体培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养72 h；将PDA平板上筛选得到的菌株接种于PDA斜面培养基，待孢子形成后，用无菌水制备菌种孢子悬液 （10⁶～10⁷个/ml）。取 2 ml 孢子悬液转接到PDA液体培养基中，30 ℃、180 r/min 摇床振荡培养72 h。

1.2.2.4 酶样制备及酶活测定。摇瓶发酵结束后，将培养液以 8 000 r/min离心 20 min，取上清液，即为酶样。酶活参照刘军昌等的方法进行测定^[13]。具体步骤如下：移取3 ml反应底物（3.5×10-2 g/L）于37 ℃保温5 min，加入稀释后的酶样0.1 ml，反应15 min后加入3 ml 10%的高氯酸溶液终止反应。对照样品方法同上，反应底物保温后，先后加入3 ml 10%的高氯酸溶液和0.1 ml的酶样。反应结束后，在波长265 nm处，用石英比色皿，以水为参比测量吸光度。酶活定义：在上述条件下1 min吸光值改变0.001，定义为1个酶的活力单位（U）。

1.2.3 霉菌菌种鉴定。

1.2.3.1 菌落形态观察。将分离纯化后的DCP23，接种于PDA培养基培养，以观察其菌落形态。具体步骤为：在倒好培养基平皿中，用接种针从斜面挑取少许孢子在培养皿中按三角顶点位置三点式接种。PDA培养基平皿在30 ℃下培养3～5 d。形成巨大菌落后进行特征观察并记录。

1.2.3.2 菌丝形态观察。于清洁的载玻片上，分别加乳酸石炭酸棉蓝染色液和灭菌生理盐水，用牙签从培养基平皿菌落边缘挑取少量孢子的菌丝或直接取少许发酵培养液置于上述液体中，然后小心盖上盖玻片，以防止产生气泡。用火柴棒轻轻敲击盖玻片表面使菌落分散，然后置于显微镜观察菌丝，于放大倍数7 000倍数下观察菌丝产孢结构和分生孢子的细微结构。

1.2.4 发酵条件对DCP23产酶的影响。用无菌水制备孢子悬浮液，血球计数，控制孢子浓度为1.0×10⁸个/ml。分别考察发酵温度、发酵时间、接种量和培养基初始pH对产酶的影响。

1.2.4.1 发酵温度对DCP23产酶的影响。调节培养基初始pH为7.0，接种量为3%，分别在24、26、28、30、32、35 ℃的温度下，180 r/min，振荡培养72 h，依据“1.2.2”测定培养液上清的酶活力。

1.2.4.2 发酵时间对DCP23产酶的影响。调节培养基初始pH为7.0，接种量为3%，30 ℃，180 r/min，分别培养12、24、36、48、60、72、84和96 h，依据“1.2.2”测定培养液上清的酶活力。

1.2.4.3 接种量对DCP23产酶的影响。调节培养基初始pH为7.0，接种量分别为3%、6%、9%、12%和15%，30 ℃温度下，180 r/min，振荡培养60 h，依据“1.2.2”测定培养液上清的酶活力。

1.2.4.4 培养基初始pH对DCP23产酶的影响。分别调节培养基初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，在接种量6%，30 ℃，180 r/min，培养60 h，依据“1.2.2”测量培养液上清的酶活力。

2 结果与分析

2.1 豆豉曲菌株的分离纯化

如图1所示，经过为期5 d的自然发酵，黄豆表面生长的微生物已十分旺盛，在不同位置长有菌落形态特征各异的菌株，有红色、紫色、白色、青黑色等颜色，且有的菌落较为光滑紧致，有的菌落呈絮状或发散状，各不相同。选取具有明显菌落特征的8个取样点进行取样，见图1b中的A～H点。

逐一挑取PDA、MRS和YPD平板上的特征菌落（图2），经过连续划线分离和培养，共计得到单一菌株51株，分别从PDA、MRS和YPD平板上各得到25株、9株和17株。PDA平板分离株依次编号为DCP01～DCP25，MRS平板分离株依次编号为DCM01～DCM09，YPD平板分离株依次编号为DCY01～DCY17。

2.2 产AMP脱氨酶菌株的筛选

将PDA、MRS和YPD平板上分离得到的纯种菌株分别采用相应的液体培养基按照“1.2.2”的条件进行发酵培养，发酵终止后，收集培养液上清，进行AMP脱氨酶酶活测定。试验结果如表1所示，具有AMP脱氨酶酶活的菌株共计16株，多数为PDA平板分离株和YPD平板分离株，其中编号为DCP23的菌株酶活最高，达到293.7 U/ml。初步确定DCP23为此批次试验的AMP脱氨酶最高产菌株，故选取DCP23进行下一步的菌种鉴定及适宜发酵条件考察。

3 结论

通过自然发酵豆豉曲的制作、豆豉曲微生物的分离纯化、AMP脱氨酶酶活检测、高产脱氨酶菌株的鉴定及其发酵条件优化，该研究获取了1株能产较高活性AMP脱氨酶的野生青霉菌株DCP23，其适宜发酵条件为：培养基初始pH 6.0，接种量6%，30 ℃发酵60 h。该条件下DCP23发酵液的酶活力达到293.7 U/ml。该菌株产酶的发酵培养基有待进一步的优化，其所产AMP脱氨酶的酶基因也有待进一步的挖掘。

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