不同倍性白桦叶芽中IAA和ABA含量分析

王遂 赵慧 李墨野 姜静

摘要 [目的]初步比较二、三、四倍体白桦叶芽中IAA和ABA含量的差异，为研究植物内源激素在不同倍性白桦生长发育过程中所发挥的作用提供参考。[方法] 利用HPLC法测定了二、三、四倍体白桦叶芽中IAA和ABA含量。[结果]对不同倍性白桦叶芽IAA与ABA含量的比较发现，多倍体白桦叶芽IAA含量均显著高于二倍体，而ABA含量则显著低于二倍体；单位质量的二、三、四倍体白桦叶芽中IAA/ABA的值分别为0.76、1.45、1.06。[结论] 染色体倍数的增加对内源激素含量产生了重要影响。

关键词 多倍体；白桦；吲哚3乙酸；脱落酸；高效液相色谱

中图分类号 S792.153 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-09418-03

Analysis of IAA and ABA in Leaf Buds of Different Ploidy Betula platyphylla Suk.

WANG Sui， ZHAO Hui， LI Moye， JIANG Jing*

（National Key Laboratory of Forest Tree Genetic Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To compare differences of IAA and ABA in leaf buds of diploidy， triploidy and tetraploidy white birches， which will provide reference for studying the role of plant endogenous hormone in growth and development process of Betula platyphylla Suk.. [Method] HPLC method was adopted to determine IAA and ABA content in leaf buds of Betula platyphylla Suk.. [Result] The comparison results of IAA and ABA content in leaf buds of different ploidy Betula platyphylla Suk. showed that the IAA was significantly higher and the ABA was significantly lower in the polyploidy than those in the diploidy， respectively. Ratios of IAA/ABA in diploidy， triploidy and tetraploidy Betula platyphylla Suk. were 0.76， 1.45， 1.06. [Conclusion] The result demonstrated that chromosome doubling has a significant impact on the content of endogenous phytohormone.

Key words Polyploid； Betula platyphylla Suk.； IAA； ABA； HPLC

白桦（Betula platyphylla Suk.）是桦木科桦木属植物，落叶乔木或灌木，主产北半球寒温带、温带地区，抗性极强，对土壤适应性广，生长快，耐干旱贫瘠，是我国北方最重要的经济和园林绿化树种之一^[1]。

笔者所在实验室前期利用秋水仙素诱导产生白桦四倍体后，又通过与白桦二倍体杂交，获得白桦三倍体杂种。初步研究发现，三、四倍体与二倍体白桦相比，高生长变化不大，径生长明显增加，苗木整体呈现出粗壮的变化趋势。目前吲哚3乙酸（IAA）与脱落酸（ABA）等植物内源激素在不同倍性白桦生长发育中所发挥的作用尚不清楚。

该试验利用高效液相色谱法（HPLC）检测白桦二、三、四倍体叶芽中IAA和ABA的含量，旨在初步比较3种不同倍性白桦叶芽中IAA、ABA的含量差异，为研究植物内源激素在不同倍性白桦生长发育过程中所发挥的作用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 供试材料。

2014年4月25日上午，在东北林业大学林木育种基地，分别取一定量的二倍体、三倍体和四倍体9年生中国白桦生长健壮的叶芽若干，迅速放入液氮中冷却后，储存在-80 ℃超低温冰箱保存待用。

1.1.2 主要试剂。

IAA为HPLC用标准品（德国Dr.Ehrenstorfer公司生产）；ABA为HPLC用标准品（美国SIGMA公司生产）；色谱级甲醇（美国Fisher Scientific公司生产）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司生产）；其余试剂均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器。

Waters高效液相色谱系统（Waters 600 四元泵，Waters 2707自动进样器，柱温箱和Waters 2996 二极管阵列检测器，Empower 3.0 色谱分析系统），Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm 5.0 μm），SepPak C18固相萃取柱（3cc），均由美国Waters公司生产；TissueLyser II样品破碎系统（德国Qiagen公司生产）；离心机和Concentrator plus 真空离心浓缩仪（由德国Eppendorf公司生产）。

1.2 研究方法

1.2.1 色谱条件。

流动相：A.甲醇，B.水（含0.1%冰乙酸）；

洗脱程序见表1。

脱气：氦气在线脱气；

柱温：30 ℃；

进样量：20 μl；

检测波长：IAA为218.7 nm，ABA为262.2 nm；

进样延迟：5 min；

运行时间：30 min。

1.2.2 标准工作液。

1.2.2.1 母液的配制。

取0.100 0 g植物内源激素，用HPLC级甲醇定容在100 ml容量瓶中，配制成浓度为1 mg/ml的母液。

1.2.2.2 单标储备液的配制。

取1 ml激素母液，用HPLC级甲醇定容在100 ml容量瓶中，配制成浓度为1×10-2 mg/ml的单标储备液。

1.2.2.3 标准工作液的配制。

利用微量移液器，将不同体积的单标储备液加入容量瓶中，用HPLC级甲醇定容，配制成2种溶质终浓度均为1×10-2、5×10-3、2.5×10-3、1×10-3、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4、5×10-5、2.5×10-5与1×10-5 mg/ml的不同标准工作液，并依次命名为标准工作液①～⑩。

1.2.3 样品前处理方法。

参照前人的相关方法，进一步改进方案为^[2-5]：

（1）准确称取白桦叶芽1 g（FW），迅速放入-80 ℃超低温冰箱待用。

（2）将储存的白桦叶芽置于球磨机中，加入液氮冷却后，在28 Hz频率下研磨0.5 min，至样品变为极细粉末，放入锡纸包好的50 ml大试管中。

（3）向大试管中加入5 ml冷的含80%甲醇，20%水的提取液。

（4）超声波冰浴振荡60 min。

（5）6 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液。

（6）收集沉淀，再用5 ml冷80%甲醇提取液提取1次，重复步骤（3）～（5）。

（7）合并2次提取液，在真空离心浓缩仪中减压浓缩至只剩水相。

（8）加入5 ml，pH=8.0的PBS（磷酸盐缓冲液）。

（9）加等体积石油醚，萃取3次，弃去有机相。

（10）加0.5 mol/L柠檬酸，调pH至2.8～3.0。

（11）加等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，减压浓缩至干。

（12）用2 ml，pH=8.0的PBS（磷酸盐缓冲液）溶解。

（13）过SepPak固相萃取柱（需先用3 ml 100%甲醇活化，再用3 ml pH=3.0的去离子水平衡），过柱流速均为1 ml/min。

（14）用1 ml pH=3.0的去离子水作为淋洗液淋洗。

（15）用含0.1%冰乙酸的80%甲醇为洗脱液洗脱，收集洗脱液。

（16）接取洗脱后的馏分，经0.45 μm的滤器过滤，减压浓缩至干，用100%甲醇（色谱纯）定容，储存在4 ℃冰箱中，备用进样。

1.2.4 数据处理方法。

利用Empower 3.0、SPSS 20.0和Excel 2010软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

将制作好的标准工作液依次进样，每1标准工作液进样3次，以标准品浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，根据两者之间的线性相关性，用Empower 3.0软件计算标准曲线方程（表2）。结果可以看出，两者线性关系良好，相关系数R²均大于0.99。

2.2 精密度和稳定性

准确吸取标准工作液⑤20 μl，连续进样3次，记录峰面积积分值。结果表明，3次进样后峰面积积分值变化不大，IAA与ABA对应峰面积相对标准偏差（R.S.D）均小于0.2%，精密度符合要求。

准确吸取标准工作液⑤20 μl，于配置后的0、6、12、24和48 h分别进样，记录峰面积积分值。结果显示，IAA与ABA 2种植物内源激素在甲醇溶液中稳定性良好，峰面积相对标准偏差（R.S.D）均小于0.6%，在试验需要的时间范围内，具有良好的稳定性。

2.3 回收率

向已知IAA和ABA含量的叶芽样品中分别加入10 000 ng的IAA和ABA标准品，用上文所述样品前处理方法处理，计算回收率，重复3次（表3）。结果表明，IAA和ABA 2种物质在复杂的前处理过程中有部分损失。故在计算完成样品中2种物质的含量后需要一个校正系数将测定值转换成一个更接近真实值的数值，根据两者的平均回收率，将IAA的校正系数定为1.35，ABA的校正系数为1.29。

果发现，普通二倍体白桦叶芽中IAA含量最低，ABA最高；三倍体的IAA含量最高；四倍体的ABA含量最低。单位质

量的二、三、四倍体白桦叶芽中IAA/ABA的值分别为0.76、

1.45、1.06。对原始计算结果进行差异显著性分析显示，不同倍性白桦叶芽中IAA含量差异极显著（P<0.01），ABA含量差异显著（P<0.05）。进一步的多重比较表明（Duncan法，α=0.05），不同倍性白桦叶芽之间IAA含量差异均显著；而ABA只在二倍体与多倍体之间差异显著。

3 结论与讨论

人们对多倍体的研究已有很长的历史，多倍体植株常较普通二倍体生长发育缓慢，开花成熟晚，含水量高，渗透压低，植物组织内碳水化合物、维生素、蛋白质、叶绿素和一部分次生代谢产物含量显著升高^[6]。笔者所在实验室前期的研究发现，多倍体白桦与二倍体白桦相比，在胸径、叶片、气孔和果序方面明显增大。这些特点与内源激素含量的变化有着很大关系^[7]。对于单个或多个基因的多拷贝，有时会对内源激素产生重要影响，而其影响大小与插入基因拷贝数的多少关系不大。就吲哚3乙酸而言，即使插入的是其合成相关基因，也不能保证最终IAA表达的含量一定上升，这可能与基因的共抑制或插入位点不同有关^[8-10]。但关于多倍体植株，尤其是木本植物内源激素的报道尚不多见。一般认为，随着染色体倍数的增加，部分植物内源激素的含量会有所上升，而上升的比例与染色体增加的倍数并无多大关

联^[11]。但也有报道发现，有时内源激素也会随着染色体倍

数的增加而降低^[12]。从此次试验的结果看，三、四倍体叶芽中IAA的含量明显高于二倍体，而ABA含量低于二倍体。观察三者的形态结构发现，三、四倍体叶芽的体积大，单个叶芽的质量也重，但芽的数量少；二倍体叶芽体积小，单芽质量

轻，而芽的数量多，这可能与植物内源激素含量和互作的变化有很大关联。通过对四倍体和二倍体白桦基因转录组数据的分析也发现，在IAA合成途径中，四倍体较二倍体共有11个差异基因，全部上调表达，这从分子角度初步阐释了多倍体白桦IAA含量上升的机理。由于材料的限制，该试验的样本数较少，其测定结果是否具有普遍性尚需进一步验证；同时，由于多倍体的复杂性，染色体倍数的增加与内源激素含量的变化关系十分复杂，因此从不同角度对其进行研究阐述亦具有重要意义。

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