球孢链霉菌JK—1抗菌物质的理化特性研究

李其利 黄穗萍 郭堂勋 莫贱友 黄俊斌

摘要 [目的]明确球孢链霉菌JK1抗菌物质的基本理化性质。[方法]以稻瘟菌为指示菌，采用菌丝生长速率法分别测定球孢链霉菌JK1发酵滤液在不同温度、不同酸碱度、蛋白酶K处理和硫酸铵盐析之后的抑菌活性；采用硫酸铵盐析对抗菌物质进行初步提纯，并通过超滤的方法初步测定该抗菌物质的分子量大小。[结果]球孢链霉菌JK1产生的抗菌物质在高温和蛋白酶K处理的情况下抑菌活性显著降低，在pH2～11条件下抑菌活性无显著变化，而pH≥11的强碱性条件下抑菌活性显著降低。饱和度为50%的硫酸铵即可将发酵液中的抗菌物质完全沉淀下来，超滤发现其分子量在10～30 kD。[结论]该研究结果为球孢链霉菌的田间应用及其抗菌物质的分离鉴定奠定了基础。

关键词 球孢链霉菌；抗菌物质；理化特性

中图分类号 S432.4+4 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）27-09356-03

Study on Physicochemical Property of Antifungal Substances from Streptomyces globisporus JK1

LI Qili1，2， HUANG Suiping1，2，GUO Tangxun1，2 et al

（1.Institute of Plant Protection，Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007；2.Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007）

Abstract [Objective] The aim was to understand basical physicochemical property of antifungal substances from S.globisporus JK1.[Method]Antifungal activity against Magnaporthe oryzae was determined after the culture filtrates of S.globisporus JK1 were treated in various temperatures，pH values，proteinase K or ammonium sulfate precipitation，using the mycelial growth rate method.The antifungal substances were purified priliminarily by ammonium sulfate precipitation，and the range of molecular weight of the antifungal substance was determined with ultrafiltration.[Result] The antifungal activity was significantly lower than control after being treated with high temperature，strong alkalinity （pH≥11） or proteinase K.However，no significant difference was observed when it was treated at the pH ranging from 2 to 11.Ammonium sulfate precipitation could be used to purify the antifungal substances preliminarily，and the molecular weight of the antifungal substance was between 10 kD and 30 kD.[Conclusion]The study result provide a basic for field application and further isolation，purification and identification of the antifungal substances.

Key words Streptomyces globisporus；Antifungal substances；Physicochemical property

链霉菌是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物类群，广泛存在于不同的自然生态环境中，种类繁多，代谢功能各异。在目前发现的数万种微生物来源的活性物质中，超过50%的都是来自于链霉菌。链霉菌可产生种类众多的农用抗生素，而且大多数已在农业生产中广泛应用，可防治真菌、细菌、线虫病害以及一些重要害虫，有的还具有除草活性^[1]。笔者于2007年在培养稻瘟菌的培养皿内发现了一株对稻瘟病菌有很强拮抗作用的链霉菌菌株JK1，通过形态学观察、生理生化测定以及16S rDNA序列分析，将其鉴定为球孢链霉菌（Streptomyces globisporus），

其发酵液对多种植物病原菌具有很强的拮抗作用，并且对水稻稻瘟病有较好的防治效果^[2]。

前人的研究主要集中于球孢链霉菌及其抗生素的抗肿瘤活性，而很少有关于其对植物病原菌的抗菌活性方面的报道^[3-4]。

然而，球孢链霉菌JK1产生的抗菌物质的热稳定性、酸碱稳定性等基本理化性质尚不清楚，而这些性质直接影响着该菌的应用范围和田间效果，也是进一步分离提纯及鉴定其抗菌物质分子结构的基础。为明确该抗菌物质的基本理化特性，笔者研究了球孢链霉菌JK1产生的抗菌物质在不同温度、酸碱度、蛋白酶K、硫酸铵盐析等方法处理的情况下其抑菌活性的变化，并采用超滤的方法初步测定了抗菌物质分子量的大小，旨在为进一步分离提纯、结构鉴定和开发利用该抗菌物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 球孢链霉菌JK1由湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室分离培养并获得。

1.2 方法

1.2.1 球孢链霉菌发酵滤液的理化性质。

1.2.1.1 球孢链霉菌JK1发酵滤液的制备。

将球孢链霉菌JK1划线接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，参照方中达^[5]的方法）培养基上，置于25 ℃恒温光照下培养6 d后，用接种针挑取少量菌落至盛有100 ml 马铃薯蔗糖培养液（PSB，参照方中达^[5]的方法）的三角瓶中（250 ml），于25 ℃、180 r/min下振荡培养6 d后，将JK1菌体悬浮液（10⁸cfu/ml）按照05%（V/V）的接种量接种到新鲜的PSB培养液中，置于同等条件下继续培养6 d即为发酵液。将发酵液离心（12 000 r/min，20 min），取上清，用0.45 μm的微孔滤膜真空抽滤后所得滤液即为发酵滤液。

1.2.1.2 热稳定性。取20 ml发酵滤液，分别置于25、30、40、50、60、70、80、90、100、110和120 ℃温度下处理30 min后，用细菌过滤器过滤后按10%的比例加入到PDA培养基中，以添加未处理的发酵滤液（4 ℃保存）和不添加发酵滤液的PDA平板为对照，每处理3次重复。将直径5 mm的稻瘟菌菌丝块接种到PDA平板中央，置于25 ℃下培养10 d后测量菌落直径。

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.2.1.3 酸碱稳定性。取20 ml发酵滤液，分别用5 mol/L HCl和5 mol/L NaOH将样品pH调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，室温下放置24 h后，按照“1.2.1.2”方法测定各处理发酵滤液的抑菌活性，每个处理3次重复。

1.2.1.4 蛋白酶K处理对发酵滤液抑菌活性的影响。

取20 ml发酵滤液，加入蛋白酶K使其终浓度为100 μg/ml，置于37 ℃下分别水浴30、60、90、120 min后，按照“1.2.1.2”方法测定各处理发酵滤液的抑菌活性，以未添加蛋白酶K的发酵滤液为对照。

1.2.1.5 硫酸铵盐析后不同组分的抑菌活性测定。

（1）硫酸铵盐析。取20 ml发酵滤液，加入固体硫酸铵至饱和度（M/V）分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。4 ℃静置过夜后，10 000 r/min离心15 min，分别收集上清液和沉淀物，并置于4 ℃冰箱内用0.02 mol/L磷酸缓冲液透析48 h测定抑菌活性。

（2）抑菌活性测定。将灭菌的滤纸片（直径5 mm）置于涂有稻瘟菌孢子液的PDA平板上（直径15 cm），无菌风吹干至培养基表面无明显水分。然后将不同处理的沉淀透析液和上清透析液用孔径为0.45 μm的细菌过滤器过滤，分别用微量移液器添加至滤纸片上，每片20 μl。以在滤纸片上添加等量的未处理粗提物、相同硫酸铵饱和度盐析处理的PSB培养液和磷酸缓冲液为对照，每个处理设3个重复。置于25 ℃恒温培养箱内培养3 d后测量抑菌圈直径。

1.2.2 抗菌物质粗提物的基本性质。

1.2.2.1 抗菌物质粗提物的制备。

将“1.2.1.1”所述发酵滤液用饱和度为80%的硫酸铵4 ℃沉淀过夜，于 4 ℃、10 000 r/min离心30 min收集沉淀。将沉淀用发酵滤液1%体积的0.02 mol/L的磷酸缓冲液（pH 6.8）溶解，置于4 ℃冰箱内用0.02 mol/L磷酸缓冲液透析48 h，冷冻干燥后-20 ℃下保存备用。

1.2.2.2 热稳定性。

将粗提物溶解于0.02 mol/L磷酸缓冲液中配制成浓度为10 mg/ml的溶液，取1 ml溶液分别置于40、50、60、70、80、90、100、110、120 ℃温度下处理30 min，以未处理的粗提物和磷酸缓冲液为对照，每个处理3次重复。按照“1.2.1.5”方法测定不同温度处理粗提物对稻瘟菌的抑菌活性。

1.2.2.3 蛋白酶K对粗提物抑菌活性的影响。

取磷酸缓冲液溶解的粗提物（10 mg/ml）1 ml，添加蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml，置于37 ℃下分别水浴30、60、90、120 min，细菌过滤器过滤后按照“1.2.1.5”方法测定各处理粗提物对稻瘟病菌的抑菌活性，以未处理的粗提物和磷酸缓冲液为对照，每个处理3次重复。

1.2.2.4 抗菌物质分子量的初步测定。

取磷酸缓冲液溶解的粗提物（10 mg/ml）各15 ml，分别加入截留分子量为10 和30 kD的超滤离心管中（Millipore，装量15 ml），在5 000 r/min、4 ℃下离心15 min，分别收集过滤液与残留物，并按照“1.2.1.5”方法测定各处理滤液和残留物对稻瘟菌的抑菌活性。以未过滤的发酵滤液和磷酸缓冲液为对照，每处理重复3次。

1.2.3 数据处理。用DPS3.01专业版软件分析不同温度、pH、蛋白酶K、硫酸铵沉淀、超滤对球孢链霉菌JK1产生抗菌物质抑菌活性的影响，百分率数据转换成反正弦值并用最小显著差数法（LSD）比较不同处理的差异显著性。用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 球孢链霉菌JK1发酵滤液的理化性质

2.1.1 热稳定性。

结果表明，发酵滤液在4～30 ℃温度下处理30 min其抑菌活性差异不显著（图1）。高于40 ℃的温度处理其抑菌活性与对照相比显著降低。在120 ℃温度下处理30 min，其抑菌活性虽与对照相比显著降低，但是发酵滤液仍然具有明显的抑菌活性，抑菌率可达58%。

3 结论与讨论

前人研究表明，球孢链霉菌在低温（≤15 ℃）培养的情况下可产生一类多肽类抗生素——冷霉素，并且发现最适于冷霉素产生的温度是12 ℃^[6-7]。在中等温度下（15～30 ℃），球孢链霉菌可产生水溶性的抗生素——力达霉素、M81和溶菌酶等^[7-9]。对球孢链霉菌JK1产生的抗菌物质的稳定性研究结果表明，其产生的抗菌物质在高于40 ℃的温度下处理或蛋白酶K处理的情况下其抑菌活性均呈下降趋势，且可被硫酸完全沉淀下来，说明该抗菌物质为蛋白类抗生素，可通过硫酸铵盐析进行初步提纯。抗菌物质在酸性和中性条件下稳定，而在强碱性条件下（pH≥11）活性显著降低。超滤的结果表明，JK1产生的抗菌物质的分子量在10～30 kD。这与前人报道的球孢链霉菌产生的蛋白类抗生素力达霉素的分子量（15 kD）较接近。然而，前人的研究多集中于球孢链霉菌产生抗肿瘤活性的抗生素方面，而对其产生的对植物病害有较好防治效果的抗菌物质的研究较少[3，10]。笔者初步研究了球孢链霉菌产生的对多种植物病原菌有拮抗作用的抗菌物质的理化特性，为该菌的田间应用提供了理论依据，同时也为分离鉴定其抗菌物质的分子结构奠定了基础。

参考文献

[1]

HOPWOOD D A.Forty years of genetics with Streptomyces： from in vivo through in vitro to in silico[J].Microbiology，1999，145（9）： 2183-2202.

[2] LI Q L，JIANG Y H，NING P，et al.Suppression of Magnaporthe oryzae by culture filtrates of Streptomyces globisporus JK1[J].Biological Control，2011，58：139-148.

[3] 李光伟，王丽非，王松梅，等.力达霉素产生菌球孢链霉菌 C1027 中 atrA 同源基因的克隆及分析[J].中国生物工程杂志，2010，30（8）： 52.

[4] GROMYKO O，REBETS Y，OSTANSH B，et al.Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and its initial characterization[J].Journal of Antibiotics，2004，57（6）： 383-389.

[5] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京：中国农业出版社，1998.

[6] OGATA K，YOSHIDA N，OHSTJGTI M，et al.Studies on antibiotics produced by psychrophilic microorganisms.I.Production of antibiotics by a psychrophile，Streptomyces sp.No.81.[J].Agricultural and Biological Chemistry，1971，35： 79-85.

[7] YOSHIDA N，TANI Y，OGATA K.Cryomycin，a new peptide antibiotic produced only at low temperature[J].Journal of Antibiotics，1972，25（11）：653-659.

[8] BRONNEKE V，FIEDLER F.Production of bacteriolytic enzymes by Streptomyces globisporus regulated by exogenous bacterial cell walls[J].Applied and Environmental Microbiology，1994，3： 785-791.

[9] REBETS Y，OSTASH B，LUZHETSKYY A，et al.Production of landomycins in Streptomyces globisporus 1912 and S.cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators[J].FEMS Microbiology Letters，2003，222： 149-153.

[10] 李其利，宁平，郑露，等.不同培养条件对球孢链霉菌 JK1 生长及其产生抗菌物质的影响[J].南方农业学报，2013，43（11）： 1682-1687.