烯唑醇·苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐对饰纹姬蛙蝌蚪的急性和联合毒性

郭赛男 童美玲 陈文君 邵伟伟 林植华 韦力

摘要 [目的]了解3种杀菌剂对水生生物的急性和联合毒性。[方法]采用静态换水方法研究了烯唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐3种杀菌剂对饰纹姬蛙蝌蚪的急性毒性及其联合毒性，并对其进行了安全性评价。[结果]在急性毒性试验中，烯唑醇在24、48和72 h的半致死浓度（LC50）分别为60.80、62.40和41.20 mg/L；苯醚甲环唑的LC50分别为11.50、10.40和9.00 mg/L；咪鲜胺锰盐的LC50分别为4930、6.40和3.00 mg/L；烯唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐对饰纹姬蛙蝌蚪的安全浓度（SC）分别为19.90、2.50和0.03 mg/L。在联合毒性试验中，烯唑醇+苯醚甲环唑的联合毒性和咪鲜胺锰盐+苯醚甲环唑联合毒性均表现为协同作用，咪鲜胺锰盐+烯唑醇联合组中除了0.6U+0.4U毒性比组均表现为协同作用外，其他3个毒性比组均表现为拮抗作用。[结论]为进一步了解农药对两栖类的毒性影响以及农药在农业中的合理使用提供了参考。

关键词 烯唑醇；苯醚甲环唑；咪鲜胺锰盐；急性毒性；联合毒性；饰纹姬蛙；蝌蚪

中图分类号 S189 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-09350-04

Acute and Joint Toxicity of Diniconazole， Difenoconazole and Prochlorazmanganese Chloride Complex to Microhyla ornata Tadpoles

GUO Sainan， TONG Meiling， CHEN Wenjun， WEI Li* et al

（College of Ecology， Lishui University， Lishui， Zhejiang 323000）

Abstract [Objective]The aim was to understand acute and joint toxicity of three fungicides against aquatic organisms. [Method] Used Microhyla ornata tadpoles as experimental model， the acute toxicity， jonit toxicity and safety evaluation of three different pesticides （diniconazole， difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex） were studied by the method of stability water tests. [Result] In acute toxicity test， the LC50 of diniconazole examined at 24， 48 and 72 h were 60.80， 62.40 and 41.20 mg/L， respectively， whereas those of difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex were 11.50， 10.40， 9.00 mg/L and 49.30， 6.40 and 3.00 mg/L， respectively. The SC of diniconazole， difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex to M. ornata tadpoles were 19.90， 2.50 and 0.03 mg/L， respectively. Among the pairwise combinations of the three pesticides， the toxicity of diniconazole+difenoconazole and prochlorazmanganese chloride complex+difenoconazole combinations showed synergistic. For the joint toxicity of prochlorazmanganese chloride complex+diniconazole combination， except 0.6U+0.4U combination showed synergistic， the other treatments showed antagonistic. [Conclusion] The results provide valuable information on the toxic effects of pesticides on amphibians and how various types of pesticides can be reasonably used in agricultural areas.

Key words Diniconazole； Difenoconazole； Prochlorazmanganese chloride complex； Acute toxicity； Joint toxicity； Microhyla ornata； Tadpoles

两栖类是生态系统中不可缺少的成员，既能影响营养物质的循环，也可作为许多物种的高质量猎物^[1]。近20年来，科学家找到了加速全球两栖类衰退的大量证据^[2-3]。两栖类易受农业污染物的威胁，因为它们有渗透性的皮肤和卵，易从环境吸收化学污染物，大多数两栖类的生活史在农药使用区域完成，其胚胎易受污染物危害，其幼体发育时间与农药使用时间一致，因此对污染物极敏感^[4]。

几十年来随着农药使用的不断增多，其对两栖类动物的生态影响也越来越多^[5-7]。农药具有影响许多水生生物类群的潜力，人们对两栖动物的影响在过去几十年里尤为关注，因为许多物种在全球有明显的衰退现象[2-3，8]。据报道，全球两栖类种群衰退的最大原因是环境问题^[9]，农药化学品排放到自然环境经常导致生境恶化及局部两栖类动物种群的灭绝。然而，在我国大部分地区，农药使用仍然十分普遍，每年有很大农药剂量流入环境或水体中，造成不同程度的污染。因此，以两栖类作为生物指示剂对环境污染物进行监测是十分有效的方法。

饰纹姬蛙（Microhyla ornata）是无尾两栖类最小的物种之一，广泛分布于我国西北、华中、华南、华东和西南地区，常在田边、临时性水塘及其附近草丛中活动和捕食^[10]。笔者研究了3种农药杀菌剂（烯唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐）对饰纹姬蛙蝌蚪的急性及其联合毒性，旨在为农业生产合理使用农药、保护饰纹姬蛙及其他两栖类动物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试动物。

于丽水学院校园内水洼中捞取饰纹姬蛙卵团，带回实验室，置于60 cm ×40 cm× 30 cm的塑料箱内，加入曝气水20 cm，自然条件下孵化。孵化后用水藻喂食蝌蚪。7日龄时，挑选大小均一[体长（5.023±0.065）mm，体重（0.010±0.002）g]、健康活泼的蝌蚪供试验用。

1.1.2 供试药剂。

烯唑醇（WP，12.5%）和咪鲜胺锰盐（WP，50%）均为江苏辉丰农化股份有限公司生产；苯醚甲环唑（EC，250 g/L）为广东省江门市植保有限公司生产。试验前，统一配制好每一种农药的原液浓度：烯唑醇为1 000.0 mg/L，咪鲜胺锰盐和苯醚甲环唑均为100.0 mg/L。试液在试验前用干净的曝气水进行稀释。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验。

参考Wei等的试验结果^[11]，采用“静态-换水式”的毒性试验方法^[12]。将烯唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐分别按0.035、0.045和0.150的等对数间距设计5个浓度试验组（烯唑醇：40.0、43.0、46.8、50.7、55.0 mg/L；苯醚甲环唑：8.0、8.8、9.8、10.8、12.0 mg/L；咪鲜胺锰盐：2.0、2.8、4.0、5.6、8.0 mg/L），并另设一个空白对照组，每个试验组设置3个平行。试验使用容积为1 L的塑料圆盒，各组试验药水为500 ml，每个盒子放10尾蝌蚪，整个试验在室温下进行。在毒性试验期间，不投食，每24 h更换一次试液。记录24、48和72 h饰纹姬蛙蝌蚪的死亡数。判断蝌蚪死亡的标准是用镊子轻夹蝌蚪的尾部，若无反应，即认为蝌蚪已死亡[11，13]。

1.2.2 联合毒性试验。

根据急性毒性试验结果，计算出每种农药在不同染毒时间的LC50，以每种农药在48 h的LC50值作为一个毒性单位（U），分别按比例（表1）进行3种农药两两联合，进行联合毒性试验^[14]，每组试验设置3个平行组，并设1个对照组。结果观察和记录方法与“1.2.1”相同。

1.2.3 数据处理。

1.2.3.1 农药浓度对蝌蚪死亡率的影响比较。

单一农药的不同浓度在相同染毒时间内对蝌蚪死亡率的影响，分别采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）和Tukeys多重比较对相关数据进行统计。统计前，先对同一染毒时间内的不同农药浓度试验组数据进行正态性和方差齐性检验。为进一步确定每种农药不同浓度、不同染毒时间以及两者的交互作用对蝌蚪死亡率的影响，采用重复检验方差分析（Repeated measures ANOVA）进行统计。用Statistica 6.0软件进行统计，数据均以平均值表示。

1.2.3.2 LC50和SC。

参照概率单位法求得各污染物对饰纹姬蛙的24、48和72 h的LC50^[14]。采用经典公式（48 h LC50×0.3）/（24 h LC50/48 h LC50）²计算SC^[15]。最后，根据国家环境保护局对化学农药环境安全评价试验准则，将农药对蝌蚪的毒性划分为3个等级：LC50>10.0 mg/L为低毒；LC50=1.0～10.0 mg/L为中等毒性；LC50<1.0 mg/L为剧毒^[12]。

1.2.3.3 联合毒性评价。

根据48 h各试验组饰纹姬蛙蝌蚪的死亡数，绘制浓度死亡曲线分析确定各毒性比之间联合作用类型。毒性比试验组的死亡率大于50%，为协同作用；若小于50%，则为拮抗作用^[14]。

2 结果与分析

2.1 单一农药对饰纹姬蛙蝌蚪的急性毒性

由表2可知，3种农药单独作用于饰纹姬蛙蝌蚪时，在相同染毒时间内（24、48、72 h），其死亡率均有所不同，且不同浓度试验组之间的死亡率比较均呈显著性差异。烯唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐的LC50均随染毒时间的增加而降低（表3），且各自的SC分别为19.90、2.50和0.03 mg/L。根据农药对水生生物的毒性等级的划分，烯唑醇为低毒性农药，苯醚甲环唑为中等毒性农药，咪鲜胺锰盐为剧毒性农药。

重复测量检验法统计结果表明，在3个试验组中，不同农药浓度和染毒时间均分别对饰纹姬蛙蝌蚪的死亡率影响显著。同时，在两者的交互作用时，所有试验组对蝌蚪死亡率的影响均显著（表4）。

2.2 3种农药对饰纹姬蛙蝌蚪的联合毒性

单因素方差分析结果表明，烯唑醇+苯醚甲环唑联合试验组中的不同毒性

比对饰纹姬蛙蝌蚪死亡率的影响差异显著（df3，8=11.485，

烯唑醇是一种高效、广谱杀菌剂，对植物的生长调节、生理活性产生影响。目前，烯唑醇主要用于植物病害防治^[16-17]。如赵莉等研究表明烯唑醇对麦蚜虫的LC50为1.603 0×1012 μg/ml^[18]，为低毒性农药。该研究表明，烯唑醇在不同的染毒时间（24、48和72 h）对饰纹姬蛙蝌蚪的毒性效应不同，LC50随染毒时间的延长而降低，SC为19.90 mg/L，也属于低毒性农药。不同浓度、不同染毒时间及其两者的交互作用均对饰纹姬蛙的死亡率影响显著。

苯醚甲环唑具有杀菌谱广、高效、安全的特点，自2003年以来在全世界农药市场中一直销售量很高，是未来杀菌剂的主流品种之一。该农药可高效防治锈病、炭疽病、黑斑病、叶枯病、早疫病、疮痂病、白粉病、茎枯病、斑点落叶病、紫斑病等多种病害。秦绍源等发现10%苯醚甲环唑水分散粒剂对柑橘黑点病进行防治，发现其抑菌浓度（EC50）为0.102 μg/L^[19]。马雪楠等研究发现30%苯醚甲环唑悬浮剂对苹果树褐斑病有较好的防治效果，其5 000倍液的防治效果达到90.96%^[20]。该研究中的苯醚甲环唑对饰纹姬蛙蝌蚪的毒性也较大，24、48和72 h的LC50分别为11.50、10.40和9.00 mg/L，SC为2.50 mg/L，该农药的不同浓度、染毒时间及其两者的交互作用均对饰纹姬蛙蝌蚪的死亡率影响显著。

咪鲜胺锰盐是咪唑类广谱性杀菌剂，其有效成分为咪鲜胺、氯化锰复合物，具有保护和铲除双重作用，可高效防治花叶病、腐烂病、炭疽病、白粉病、青霉病等。蔡美兰利用50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂防治芒果炭疽病，发现1 000～2 000倍液对芒果炭疽病具有明显的防治效果^[21]。秦绍源等利用50%咪鲜胺锰盐可湿粉对柑橘黑点病进行防治，EC50为0186 μg/L^[19]。该研究中咪鲜胺锰盐对饰纹姬蛙蝌蚪的毒性作用为剧毒性，24、48和72 h的LC50分别为49.30、6.40和3.00 mg/L，SC为0.03 mg/L，其浓度、染毒时间及其相互作用均对饰纹姬蛙蝌蚪死亡率影响显著。

在3种农药的两两联合毒性试验中发现烯唑醇与苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐与苯醚甲环唑的联合毒性均表现为协同作用，而咪鲜胺锰盐+烯唑醇联合组中除了0.6U+0.4U毒性比组表现为协同作用外，其他3个毒性比组均表现为拮抗作用。因此，饰纹姬蛙在面对3种单一农药及其联合毒性作用时，响应机制可能较复杂，这可能与物种和发育历期、农药染毒的持续时间和强度有关^[22]。

该研究报道了烯唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐3种农药对饰纹姬蛙蝌蚪的急性毒性效应，每种农药的不同浓度及染毒时间，以及农药的两两联合作用均对饰纹姬蛙蝌蚪死亡率产生显著影响。该研究结果可用于烯唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐毒性的监督管理以及我国水体区域的生态监测。

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