Polycomb家族基因獴mSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

邢秋婷 郭兴国 邢万静 阚云超 乔惠丽

摘要 [目的] 研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况。[方法] 根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列，设计特异引物，利用qRTPCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究。[结果] BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2 d和变态前2 d有较高表达，而在1～5龄取食中期表达量较低，表达特征具有一定的规律性。 [结论] BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用，该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础。

关键词 家蚕；polycomb蛋白；Su（z）12基因；表达

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-09286-02

Study on Expression of Polycomb Group Gene BmSu（z）12 in Silkworm Larvae.

XING Qiuting， GUO Xingguo， XING Wanjing， QIAO Huili et al

（Henan Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Mountain， Nanyang Normal University， Nanyang， Henan 473061）

Abstract [Objective] The aim was to study the expression of polycomb group gene BmSu（z）12， in silkworm larvae. [Method] Based on the predicted BmSu（z）12 gene sequence in the genome of silkworm， the specific primers were designed. qRTPCR was applied to analyze the expression of BmSu（z）12 in different instar larvae of silkworm. [Result] The expression level of BmSu（z）12 was high in the first and the last 2 days of the 5th newly molted larvae， low expression was observed in the eating larvae of each instar. It showed regular expression patterns in the different developmental stages of larva. [Conclusion] BmSu（z）12 may have important roles in the development of the silkworm larvae， the study will provide fundamental knowledge for further investigation of SU（Z）12 protein function in silkworm.

Key words Silkworm； Polycomb protein； Su（z）12 gene； Expression

Polycomb蛋白复合体（Polycomb Group Proteins，PcG）是通过对组蛋白进行甲基化修饰来调控靶基因的表观遗传调控因子，广泛存在于果蝇、线虫、小鼠、人和拟南芥等各种生物体中，在进化上高度保守。PcG蛋白家族最初在果蝇中被发现，主要包含2个核心蛋白复合体，即PRC1（Polycomb Repressive Complex 1）和PRC2（Polycomb Repressive Complex 2），其中PRC2在转录抑制起始阶段发挥作用，PRC1主要维持处于阻抑状态染色质的稳定性^[1-4]。

在果蝇中，PRC1是由PC、PH、PSC和dRing组成的一个蛋白复合体，PRC2主要包括ESC、E（Z）、Rpd3、SU（Z）12和组蛋白结合蛋白p55/RbAp48^[5-6]。在哺乳动物中，PRC1由HPC、HPH、Bmi1/Mel18和Ring1A/B组成，PRC2由EED、EZH2、SU（Z）12、RbAp48和AEBP2组成，其中PRC2催化核心组蛋白的甲基化，而甲基化的组蛋白为PRC1复合体识别和结合提供位点^[7]。

近年来，PcG蛋白作为转录水平上的表观遗传修饰因子和细胞命运的调节子受到越来越多研究者的关注。在生物生长发育和病变过程中，PcG蛋白通过形成多复合体，作用于染色体上的不同位点，致使染色体变构，以期调控基因表达^[8]。PcG蛋白的主要作用靶标是Hox基因簇，Hox基因在决定细胞的定向分化与增殖、调控机体组织器官发育方面起决定性作用。其中PRC2主要参与H3K27的甲基化修饰来抑制靶基因的表达，而SU（Z）12是PRC2蛋白复合体发挥其内在的组蛋白甲基转移酶（Histone methyltransferase，HMTase）活性所必需的成分之一，其VEFS结构域在果蝇、人和拟南芥中高度保守，目前发现SU（Z）12在胚胎发育、细胞周期、细胞增殖和分化的调控中起着极其重要的作用^[9-12]。

家蚕作为人类最早驯化的动物之一，是我国重要的特色经济昆虫，且作为鳞翅目昆虫的模式生物，在研究昆虫变态发育及农林业害虫防治中也发挥着重要作用，同时家蚕具有大量的Hox基因。笔者根据家蚕基因组中预测的BmSu（z）12基因序列，利用PCR法对家蚕BmSu（z）12基因VEFS结构域进行克隆，并利用qRTPCR研究BmSu（z）12在家蚕不同龄期幼虫的表达情况，从而为进一步研究家蚕中BmSu（z）12的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以家蚕品种大造P50作为试验材料，用新鲜的桑叶饲养。分别取1～4龄幼虫和5龄每天的整蚕，解剖去中肠并用DEPC水冲洗。所有样品迅速置于无RNA酶的离心管中，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 引物

PCR扩增所用引物序列（5′～3′）BmSu（z）12F：GAGTTCCTAGAGCTGGACGA；

BmSu（z）12R：GAGCATCTGAACGGTCT；

BmactinA3F：ATGTGCGACGAAGAAGTTGC；

BmactinA3R：GTCTCCTACGTACGAGTCCT。由奥科生物技术有限公司合成。

1.3 家蚕幼虫RNA提取及BmSu（z）12基因克隆

采用Trizol（Invitrogen）法，提取家蚕幼虫整蚕样品RNA，利用PrimeScript II反转录试剂盒（TaKaRa）反转录为cDNA后，以其为模板进行后续试验。

根据家蚕基因组中预测的BmSu（z）12基因序列BGIBMGA011842PA设计引物。以家蚕5龄第1天幼虫cDNA为模板进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次；72 ℃延伸10 min。将纯化后的扩增产物与pMD19T simple连接后，转化至大肠杆菌（E.coli）DH5α，挑取阳性克隆，进行测序验证。

1.4 BmSu（z）12基因在不同龄期幼虫中表达的qRTPCR分析

qRTPCR检测的内参基因为家蚕BmactinA3（GenBank登录号：U49854）。BmactinA3和BmSu（z）12引物序列见“1.2”。反应检测仪为BioRad 公司的CFX96系统，qRTPCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，溶解曲线在65 ～95 ℃用来判定产物特异性。每个样品设3个重复，BmSu（z）12基因mRNA的相对表达量用2-△CT表示，其中△Ct=Ct（目的基因）- Ct（内参基因）。

2 结果与分析

2.1 BmSu（z）12基因片段的克隆

通过PCR方法，从家蚕幼虫RNA反转录的cDNA中克隆BmSu（z）12基因423 bp的片段，产物经奥科公司测序正确，表明为目的基因。

2.2 BmSu（z）12基因在家蚕幼虫不同时期的表达分析

采用qRTPCR方法对BmSu（z）12在家蚕不同龄期幼虫的表达情况进行定量检测，结果见图1。由图1可知，BmSu（z）12基因在家蚕1～4龄的幼虫中表达量较低，而在5龄各时期样品中的表达量相对较高，并呈一定的规律。在刚蜕皮后的5龄第1天、第2天和进入变态前的5龄第7天、第8天表达量较高，而在5龄中期（第3、4、5、6天）的表达量较低。

3 讨论

PcG蛋白家族通过催化组蛋白H3的27位赖氨酸的甲基化水平来调控靶基因表达，并广泛参与到发育、增殖、分化及肿瘤发生等重要的生命过程。SU（Z）12本身没有甲基转移酶活性，但其对PRC2复合体的功能具有重要作用。研究表明，在过表达SU（Z）12的果蝇突变体中可以检测到H3K27me3的甲基化程度明显增加，而敲除SU（Z）12的突变体中H3K27me3完全消失^[13]。该试验在家蚕幼虫中克隆获得PcG蛋白PRC2复合体中的重要组分BmSu（z）12基因的VEFS结构域，将其编码氨基酸序列与其他物种的同源序列进行比对，发现其与果蝇和人类Su（z）12分别有72%和52%的序列相似性。BmSu（z）12家蚕幼虫的qRT PCR结果显示，BmSu（z）12基因在5龄幼虫中蜕皮后2 d和变态前2 d表达量较高，而在1～5龄取食中期表达量较低，该表达特征具有一定的规律性。因为在幼虫蜕皮后和变态前家蚕各组织都处于组织重构状态，新的组织细胞将准备进行分化；而到取食中期，家蚕体内组织功能回归正常，分化过程放缓，表明BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中起着重要作用。研究发现，在果蝇SU（Z）12突变体中发现果蝇产下的卵不能正常发育^[13]；家蚕中Su（z）12在胚胎发育早期大量表达，晚期逐渐降低^[14]，表明该蛋白在胚胎发育过程中也发挥功能；在哺乳动物细胞中敲除SU（Z）12后导致细胞形态变小，进一步表明SU（Z）12可能在细胞分化中发挥作用^[15]；最近的研究发现，Su（z）12在不同人类肿瘤中表达明显上调，因此可能是一种新的肿瘤基因治疗的分子靶点^[16-18]。家蚕属于完全变态发育昆虫，幼虫期每个龄期之间都要经历眠和蜕皮的过程，不同阶段发育过程中细胞的重组和分化都非常重要。因此通过对BmSu（z）12在幼虫中表达特征的研究，将为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能提供理论依据。

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