4种常见鲤科鱼类DNA条形码的研究

王茜 金毅成

摘要 测定了天津地区养殖的彭泽鲫、黄金鲫、乌克兰鳞鲤、鲤鱼4种共13尾鱼长度为814 bp的COI部分基因序列，以白鲢、罗非鱼作为外群。利用Mega4.1软件进行序列组成统计分析、种内及种间遗传距离分析，并用邻接法构建系统发育树（NJ树），在NJ树上共发现由不同物种组成的5个分支，这与传统的分类学结果一致。该研究结果显示，COI基因部分序列不但可以作为物种辨识的良好DNA条码，而且在鲤科鱼类的种间系统发生关系分析方面也具有一定的适用性。

关键词 鲤科鱼类；DNA条形码；分子系统学；COI基因

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）27-09281-02

Study on DNA Barcoding of Four Common Cyprinidae Fish

WANG Qian， JIN Yicheng

（Tianjin Key Lab of Aquatic Ecology and Aquaculture， Department of Fishery Science， Tianjin Agriculture School， Tianjin 300384）

Abstract The partial COI gene of Pengze crucian carp， gold crucian carp， ukraine scaly carp， carp， silver carp and tilapia fish in Tianjin were studied. 814 bp DNA fragments were obtained and the sequences were analyzed. Statistics of sequence compositions and genetic distance were obtained by using MEGA4.1 software. The phylogenetic tree was also performed by using neighborjoining method. The result showed： the 15 species could be divided into five groups. This is consistent with the results of the taxonomy. And the study indicated that the partial sequence of COI gene was not only a good DNA barcode to identify different species， but also had certain applicability in the analysis of interspecific phylogenetic relationships of Cyprinidae.

Key words Cyprinidae； DNA barcoding； Molecular systems； COI gene

利用DNA条形码技术鉴别己知物种和发现新物种构建条形码标准数据库，是目前分子生物学和分类学发展的最新方向^[1-3]。与其他分子标记如RFLP、RAPD、基因芯片技术相比，DNA条形码具有易于构建统一的DNA 条形码数据库；重复性高；使用方便等优势。2003年在美国CSHA（The Cold Spring Harbor Asia Conferences）召开的全球会议制定了国际生命条形码计划（International Barcode of Life projeet）的编定计划，并首次将DNA条形码技术用于海洋生物的普查研究^[4]。很多国际组织也自行建立DNA条形码数据库，有较大影响和较大规模的组织包括FISH-BOL、Canadian Fauna和Birds等。FISH-BOL组织计划对所有鱼类进行DNA条形码数据库的建立，重点针对1.5万种海洋鱼类的DNA条形码，目前己经获得5 000多种鱼类的DNA条形码数据。WARD等^[5]对澳大利亚207种海洋鱼类进行DNA条形码的测序，发现所研究的鱼类都能被COI有效区分，并认为COI基因可以反映这些鱼类的系统发育关系。 LAKRA等^[6]对印度洋37科79属115种海洋鱼类进行DNA条形码研究，并证明了种内遗传距离明显小于种间遗传距离，从NJ树上显示COI基因可以清楚地反映鱼类的系统发育关系，且与传统形态学的分类地位基本吻合，得出该基因可以作为DNA条形码解决印度鱼类中存在分类模糊的问题。彭居俐等^[7]分析了鱼类32尾的COI基因序列，结果表明，基于COI基因的DNA条形码在识别鱼类物种方面与传统形态学基本吻合，且该基因可以探讨鱼类种间的系统发育关系，认为COI基因作为鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有可行性。周佳怡^[8]验证了线粒体COI基因在石斑鱼亚科物种鉴定中的有效性以及DNA条形码用于石斑鱼亚科的系统发育分析的可行性。笔者对4种常见鲤科鱼类DNA条形码进行了研究，为进一步研究鱼类分子系统以及物种分化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲤鱼（L）、黄金鲫（H）、彭泽鲫（PJ）、乌克兰鳞鲤（W）、罗非鱼（LF）、白鲢（BL）采自天津市换新水产良种场，用95%的乙醇保存。

1.2 DNA提取

DNA提取采用常规的苯酚-氯仿法。

1.3 PCR扩增

（1）PCR扩增的目的片段为COI基因的部分序列，扩增引物参照文献[7]，L5956co1：cacaaagacattggcaccct；H6855co1：agtcagctgaakacttttac。

（2）PCR反应体系：PCR反应体系为50 μl，PCR反应体系中各组分的量：DNA 1 μl（约100 ng），缓冲液 5 μl（10×），Mg2+ 5 μl（25 mmol/L），引物1和2各2 μl（10 μmol/L），dNTP 1.25 μl（10 mmol/L）， Taq酶 0.4 μl（5 U/μl），水33.35 μl。

（3）PCR反应程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。同时，设置空白对照。

1.4 PCR产物测序

选择条带明亮、清晰的扩增产物进行测序，在北京华大基因有限公司ABI3730自动测序仪上完成测序。

1.5 数据处理

将测序结果校正后在NCBI中进行相似性搜索，确保所得序列的准确性。后将15条序列进行比对。使用MEGA4.1软件对对比结果进行分析。计算各样本之间的遗传距离（及其标准差），各数据组碱基的组成（nucleotide composition）、变异位点（variable sites）、保守位点（conserved sites）、简约信息位点（parsimony information sites）、自裔位点（singleton sites）等。利用Mega 4.1并基于pdistance模式，采用NJ法重复1 000次分别构建分子系统树。

2 结果与分析

2.1 COI条形码序列特征分析

对所测序列进行分析，T、C、A、G碱基平均含量分别为28.8%、27.3%、26.3%、176%，显示G碱基相对贫乏，其中A+T含量（55.1%）略高于C+G含量（44.9%），即鱼类COI基因表现不明显的碱基组成偏向性。其中变异位点218个，保守位点596个，简约信息位点130个，自裔位点88个。分别占整个序列的2671%、73.04%、15.93%和10.78%。转换位点（66）明显多于颠换位点（24），转换颠换比2.48，表明基因序列的突变未达到饱和，适用于系统发育分析。碱基序列转换成氨基酸序列后，将对准后的序列采用MEGA4.1软件对每个样本mtDNA COII编码区的氨基酸组成及密码子使用频率进行分析，结果显示，COI基因816 bp共编码238个氨基酸，其中36个发生了变异，变异率为15%。由21种氨基酸组成，其中丝氨酸（Ser）、异亮氨酸（Lie）含量最高，平均含量分别为1147%和14.21%。谷氨酸（Glu）含量最低只有1.02%，反映出COI基因在氨基酸组成上有一定的偏向性；同时通过各个序列氨基酸含量分析可知，21种氨基酸在序列中的含量差异不大。

2.2 COI条形码遗传距离分析

6个物种15条COI基因序列基于pdistance模型构建的邻接树见图1。由图1可知，15个物种的种内平均遗传距离在0～8.42%，L1、L2与L3种内平均遗传距离较大为1.38%，H1与H2、H3的种内平均遗传距离为1.22%，PJ1与PJ2，PJ3种内平均遗传距离最小为002%。所有鱼类的种间平均遗传距离为18.23%，显著大于种内平均遗传距离（0.86%）。

3 讨论

（1）该研究表明，序列中没有碱基的插入、缺失，T、C、A、G碱基平均含量分别为28.8%、27.3%、26.3%、17.6%，其中A+T含量（55.1%）略高于C+G含量（44.9%），此结果与周佳怡^[8]研究我国沿海石斑鱼的DNA条形码的结果相似（其结果为T、C、A、G碱基平均含量分别为30.2%、276%、243%、17.9%，其中A+T含量54.5%高于C+G含量455%），即鱼类COI基因表现出不明显的碱基组成偏向性。DESALLE等^[9]指出，在DNA进化过程中，转换发生的频率比颠换高的多，这是由于分歧较近的物种间编码区DNA序列较多发生同义突变的结果，但对于分歧关系较远的物种，序列的转换已趋于饱和，碱基替换的形式由以转换为主转向以颠换为主，转换与颠换的比值随分歧时间而逐渐变小。HOLMQUIST^[10]认为该临界值约为0.4，该试验碱基转换位点66个明显多于颠换位点24个，转换颠换比（R）2.48，表明基因序列的突变未达到饱和，适用于系统发育分析。各个序列氨基酸含量分析显示，21种氨基酸在33条序列中的含量差异不大。同时同义密码子的使用存在一定的偏倚，且这种现象较普遍，梁菲菲^[11]在密码子偏性的影响因素及研究意义中有清晰的阐释。

（2）物种的种内差异和种间差异之间存在一个容易辨认的界限，可作为辨别是否属于同一物种的标准。HEBERT等^[12]认为COI基因序列有效地进行物种鉴定的关键点在于种间的遗传距离必须大于种内的遗传距离，即物种的种内COI序列的遗传距离一般小于1%，且距离差异约达10倍。该研究通过对鱼类15个个体基于pdistance模型计算的种内平均遗传距离在0～8.42%，小于1%的占82.43%，小于2%的占94.86%。HEBERT等^[13]对11个动物门共计13 320个物种进行遗传距离的统计分析，发现大部分种内的遗传距离小于2%，一般都小于1%，这与该试验结果相似。GOVINDARAJU^[14]等采用随机扩增多态性（RAPD）技术对印度洋沿岸7种石斑鱼的研究发现种内遗传距离很近（108%），与该试验结果一致；种间平均遗传距离为18.23%，与周佳怡^[8]研究的石斑鱼的结果（石斑鱼亚科10属60个物种共计381尾样本的种间的遗传差异在4.95%～13.47%）相似；HEBERT等^[15]对北美260种鸟类进行COI基因序列测定结果显示，鸟类COI基因序列在属内种间的平均遗传距离为793%，而种内遗传距离为0.43%。这表明该试验结果的合理性。

（3）在NJ树上共发现5个分支显示不同物种组成，BL和LF作为外群在树的基部最早被分开，L1、L2与L3聚为一支（支持率为89%、65%）。H1、H2、H3聚为一支（支持率为99%）。PJ1、PJ2、PJ3聚集，且达到100%。从NJ树可以很好地将不同种的鱼类区分开来。W1与W4关系较近，构成一个支系（支持率为78%）；W2与W3聚为一支（支持率为84%）。但这2个分支并没有聚成姐妹群，且遗传距离较大，造成这部分分支混乱的原因有待进一步探讨。该研究从构建的NJ树上的部分系统发育信息可以得出，COI基因是一个有效的DNA条形码标准基因，但由于试验测定的鱼类种类及尾数偏少，因此需要采用更多分子数据，综合其形态学、骨骼学等资料进一步研究，获得更为真实的鱼类各属间的系统发育关系。

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