改良兽药水针剂药敏试验方法

刘海林　荆汝顶

药敏试验在治疗畜禽细菌性疾病中发挥着重要的作用，可以减少因盲目用药造成的经济损失。然而很多兽药专用药物的药敏片在国内很难买到，且有些兽药抗生素为复方制剂，直接购买的药敏片不能满足临床试验需要。经过长期实践，探索出一种兽药水针剂的简易药敏试验方法。此方法操作简单能直接反应商品化兽药抗生素对分离细菌的敏感程度，现以大肠杆菌为例将该方法介绍如下。

1 设备及材料

1.1 仪器设备

立式高压灭菌器，型号为LDZX-30KBS；生化培养箱，型号为250B；电热恒温培养箱，型号为DNP-9082BS-Ⅲ；超净工作台，型号为SW-CJ-1F型；进口10 μL移液器滴头，生产厂家为AXYGEN公司；0.5-10 μL或0.1-2 μL移液器，芬兰BIOHIT公司生产；游标卡尺或学生用尺，另外，镊子、玻璃平皿、500 mL三角瓶、酒精灯、接种棒、医用棉签等购自当地医疗器械公司，6 mm打孔器购自当地文具店。

1.2材料

MHA、MHB琼脂北京陆桥科技有限公司生产，新华一号滤纸，去离子水或蒸馏水为本单位自制，待检菌株自备。

2 方法

2.1 培养基的制备

MH肉汤（MHB）制备：称取MHB原粉2.5 g，用100 mL蒸馏水进行溶解并测定pH值，若pH值不在要求的7.2-7.4范围内，应当用HCl或NaOH进行调节。调节好pH值的MHB放到高压灭菌器内121℃高压15 min备用。

MH琼脂（MHA）制备：根据培养基说明称取7.6 gMHA琼脂粉，用200 mL蒸馏水进行稀释，充分溶解后调节pH 值，然后121℃高压15 min。待培养基冷却到50℃左右时倒入灭菌平皿中，平皿中琼脂的厚度在4～5 mm为宜，冷却后的培养基平板要随机进行无菌抽检，抽检合格的琼脂板放到冰箱2～8℃保存，尽量在一周内用完。

2.2 受试菌的制备

将临床分离好的致病菌用MH肉汤进行增菌培养，然后将增菌后的菌液用生理盐水或MH肉汤稀释到0.5麦氏比浊管浊度，备用。

2.3 临床兽药水针抗生素准备

目前临床上应用的兽药水针抗生素用量上一般为0.05～0.2 mL/（kg·bw），试验前将用量不同的水针用蒸馏水（或规定的稀释液）进行稀释，统一到相同用量，如：都转换为0.1 mL/（kg·bw）。然后将统一过用量的药物装到干净灭菌的青霉素小瓶中，贴上制备时间等必要的记录备用。

2.4 药敏试验用纸片制备

用6 mm打孔器将新华一号滤纸打成圆形小纸片，然后装于容器中高压灭菌后烘干备用。

2.5 改良纸片法操作步骤

2.5.1 用灭菌棉签浸入到调整好比浊度的菌液中，将棉签在容器壁上旋转几次，除去多余的液体，然后取MHA琼脂板，用棉签在琼脂上划线均匀涂布，每次旋转60度，整个平板反复涂擦2次以上，最后用棉签沿琼脂边缘涂抹一圈。如果水分过多可以打开盖子3～5 min，以便在放置药敏片之前晾干表面水分。

2.5.2 将灭菌烘干的滤纸片表面用永久性记号笔标上数字编号，每个带有数字的纸片对应一种待检水针药物，然后把各纸片均匀放置在平皿上，每两个纸片的距离在20 mm以上为宜。

2.5.3 用0.1～2 μL移液器吸取准备好的各种水针药物1 μL并滴加到对应编号的纸片圆心位置。所有药物滴加完毕后，盖好平皿静置3～5 min，使各种液体药物在纸片上均匀扩散开。

2.5.4 然后将平皿倒扣放置于35±2℃的恒温培养箱中孵育8 h以上，最好孵育16～18 h。

2.5.5结果判定

达到要求的培养时间后，检查接种细菌生长是否良好，如果生长良好会有融合生长的菌苔出现，药敏片周围会出现无细菌生长的圆圈。如果平板上出现的是单个的菌落，说明配制的菌液过稀或培养基营养成分不符合细菌生长要求，这种情况应当查找原因重新试验。符合判读要求的平板，用游标卡尺在琼脂板背面量取各药敏片的抑菌圈直径，每个抑菌圈量取2次，取2次的平均值作为最终结果，将结果填写到细菌药敏试验记录表上，以便比较各种药物敏感情况。

通过用标准菌株（大肠杆菌ATCC25922）多次试验证明，成分及含量与包装上标明的相符且用量在0.1～0.2 mL/（kg·bw）的兽药水针，按照1～1.5 μL/片的含量进行试验，结果可以参考CLSI规定的K-B纸片法判定标准进行判定。成分不明或复方制剂可以通过比较相同试验条件下产生的抑菌圈大小来大概评估各种兽药的抑菌效果。

3 结果

通过改良的水针剂药敏试验方法，可以直接的反映出商品化水针剂对分离细菌的敏感程度，筛选出敏感性抗生素进行有针对性的治疗，大大提高了兽医临床上细菌病的治愈率。

4 讨论

由于很多兽药抗生素目前在国内没有商品化的标准药敏片（如：氟苯尼考、达氟沙星等），改良水针药敏试验可以直接利用水针剂药物进行试验，通过对不同药物抑菌圈大小进行比较，而筛选出敏感性药物，解决了因无药敏片而无法试验的问题。

该方法直接用水针剂进行试验，筛选敏感药物，省去了传统方法先制作药敏片的程序，节省时间。

目前兽药市场比较混乱，部分兽药抗生素实际成分与标明的不符，如果用购买的标准化的药敏片进行试验然后去筛选对应的兽药很可能达不到预期的疗效，本方法直接用商品化药物进行试验，筛选出来的药物针对性更强，疗效更显著。

经过实践证明，在选择合适的培养基的条件下，该方法对于一些营养要求较高的苛性细菌进行药敏试验效果均很理想。

抗生素耐药情况与当地使用抗生素的习惯有关，有一定的地域性差别，兽医门诊可以采用此方法很快评估出新购进的水针兽药在当地的敏感情况，比采用临床治疗加回访疗效的评估的方法所需的时间短、见效快。（编辑：狄慧）