兔病毒性出血症4种灭活疫苗的研制及效果比较

权英存　刘虎守

摘要[目的] 研制兔病毒性出血症新型疫苗。[方法]分别以黄芪多糖、蜂胶、铝胶、生理盐水为佐剂，研制兔病毒性出血症黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗，并从安全、免疫效果等方面对这4种疫苗进行比较。[结果] 4种疫苗均有良好的安全性。免疫后7 d 4种疫苗产生的特异性抗体效价均逐步升高，攻毒保护率均达到100%。免疫后14 d黄芪多糖佐剂抗体效价显著高于蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗。免疫后180 d黄芪多糖佐剂疫苗的保护率达75%，蜂胶佐剂与铝胶佐剂可达到50%，常规灭活疫苗的保护率达25%。[结论] 这4种疫苗均具有良好的安全性和免疫原性，其中黄芪多糖灭活苗的免疫效果最好。

关键词兔病毒性出血症；黄芪多糖；蜂胶；铝胶；灭活疫苗；免疫效果

中图分类号S829.1文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03573-03

基金项目青海省大通县农技推广补助项目。

作者简介权英存（1983- ），女，青海大通人，助理兽医师，从事动物医学方面的研究。

兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称兔瘟，是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起兔的一种急性、烈性、高度接触性传染病[1-2]，该疾病传播速度快、发病率和死亡率均较高，兔群一旦感染该病，将造成毁灭性灾难，是危害养兔业健康发展的头号杀手[3]。该病首次爆发于我国江苏地区[4]，现已呈世界范围内流行，给全球的养兔业带来了巨大的经济损失[5-7]。目前，国内对该病的防控主要使用常规灭活疫苗进行免疫接种，随着对动物免疫增强剂研究的不断深入，黄芪多糖、蜂胶等具有抗菌、消炎、增强机体免疫功能等生物学功能的纯天然药物不断得到开发和应用[8-11]。笔者用黄芪多糖和蜂胶作为疫苗佐剂，制备RHDV灭活疫苗，并比较RHDV黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗的免疫效果，以期为黄芪多糖和蜂胶在动物疫苗佐剂中的开发和应用奠定基础，为RHDV新型疫苗的研制开发和应用提供科学依据。

1材料与方法

1.1病毒与试验兔兔病毒性出血症病毒（组织毒）由青海畜牧兽医职业技术学院实验室分离并保存；未免疫过兔病毒性出血症病毒疫苗的健康易感兔购自青海民和绿之苑兔业有限公司下属养殖场。

1.2佐剂黄芪多糖购自西安康威生物工程有限公司；蜂胶购自青海门源蜂产品公司。

1.3兔病毒性出血症病毒灭活抗原的制备与检验

1.3.1灭活抗原的制备。将兔病毒性出血症病毒（组织毒）与灭菌生理盐水（质量体积比约为1∶4）充分研磨捣碎，经颈部皮下注射2月龄健康易感兔，每只注射2 ml，无菌取攻毒后24～72 h死亡兔的肝脏组织与灭菌生理盐水（质量体积比约为1∶4）充分研磨捣碎，经甲醛灭活后，4 ℃下保存备用。

1.3.2灭活抗原的检验。按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行灭活抗原对人“O”型红细胞凝集效价的测定和细菌、霉菌、支原体的检测。

1.44种佐剂兔病毒性出血症灭活疫苗的制备

1.4.1蜂胶佐剂灭活疫苗的制备。将蜂胶碾碎过20目药筛后，与无水乙醇（质量体积比约为1∶4）充分混合，置于37 ℃下作用48 h，取上清液即为纯化的蜂胶乙醇浸液。将兔病毒性出血症灭活抗原与蜂胶乙醇浸液按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症蜂胶佐剂灭活疫苗。

1.4.2黄芪多糖佐剂灭活疫苗的制备。将黄芪多糖用蒸馏水配制成浓度25 mg/ml的溶液，高压蒸汽灭菌，即得黄芪多糖佐剂。将兔病毒性出血症灭活抗原与黄芪多糖佐剂按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症黄芪多糖佐剂灭活疫苗。

1.4.3铝胶佐剂灭活疫苗的制备。将三氯化铝用蒸馏水配制成8%的溶液，加温至56～60 ℃，用氢氧化钠溶液缓慢调节pH至5.6～6.0，高压蒸汽灭菌，即得铝胶佐剂。将兔病毒性出血症灭活抗原与铝胶佐剂按等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症铝胶佐剂灭活疫苗。

1.4.4常规灭活疫苗的制备。将兔病毒性出血症灭活抗原与灭菌生理盐水等体积充分混合，加入硫柳汞（占总体积的0.01%），即为兔病毒性出血症常规灭活疫苗。

1.54种疫苗的物理性状检验按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗的剂型、稳定性等物理性状检验。

1.64种疫苗的无菌检验按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版中的方法分别进行兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗的细菌、霉菌、支原体的检测。

1.74种疫苗的安全性检验分别将兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗经颈部皮下各注射健康易感兔10只，注射劑量为4 ml/只，观察10 d，免疫兔应无任何不良反应。

1.84种疫苗的效力检验

1.8.1试验设计与分组。将120只健康易感家兔随机分为5组（对照组、试验I组、试验II组、试验III组、试验IV组），每组24只。试验I组、II组、III组、IV组分别免疫兔病毒性出血症蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水佐剂灭活疫苗，剂量为1 ml/只，对照组免疫灭菌生理盐水。

1.8.24种疫苗抗体效价的比较。分别在免疫后7、14、28、60、90、180 d从每组中随机抽取4只试验兔于耳静脉采血后分离血清，通过血凝抑制试验（HI）测定血清中兔病毒性出血症抗体效价。使用SPSS软件对试验数据进行统计与方差分析，结果以“平均值±标准差”表示。

1.8.34种疫苗攻毒保护的比较。在7、14、28、60、90、180 d采血后的4只试验兔分别经颈部皮下注射兔病毒性出血症病毒，剂量为1 ml/只，隔离饲养，观察7 d，记录各组兔的发病和死亡情况，计算各组兔保护率，比较4种疫苗的免疫保护效果。

2结果与分析

2.1兔病毒性出血症灭活抗原的检验采用血凝试验（HA）测定灭活抗原对人“O”型红细胞的凝集效价为1∶1 024；按照现行兽药典的方法检验灭活抗原无细菌、霉菌和支原体生长。

2.24种疫苗的物理性状检验按照现行兽药典的方法检验4种灭活疫苗均为均匀混悬液。

2.34种疫苗的无菌检验按照现行兽药典的方法检验4种灭活疫苗均无细菌、霉菌、支原体生长。

2.44种疫苗的安全性检验4种灭活疫苗注射的健康易感家兔全部健活，无任何不良反应。

2.54种疫苗的效力检验

2.5.1抗体效价的比较。由表1可知，在免疫后的7 d 4种疫苗RHDV抗体效价均逐步升高，其中以黄芪多糖佐剂灭活疫苗的效价最高，铝胶佐剂灭活疫苗的抗体效价最低，黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂显著高于铝胶佐剂（P<0.05）；免疫后的14 d，黄芪多糖佐剂灭活疫苗显著高于蜂胶佐剂、铝胶佐剂以及常规灭活疫苗（P<0.05）；免疫后的28 d，黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂灭活疫苗抗体效价相当，差异不显著（P>0.05），均显著高于常规灭活疫苗（P<0.05）；免疫后的60 d，4种灭活疫苗的RHDV抗体效价仍然维持在较高水平，黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂铝胶佐剂灭活疫苗的抗体效价均显著高于常规灭活疫苗（P<0.05）；免疫后的120 d，4种灭活疫苗的RHDV抗体效价均有所下降；免疫后的180 d，黄芪多糖佐剂、蜂胶佐剂、铝胶佐剂灭活疫苗抗体效价仍维持在5 log2以上，其中以黄芪多糖佐剂抗体效价最高，其显著高于常规灭活疫苗差异（P<0.05）。

2.5.24种疫苗攻毒保护效果的比较。由表2可知，在免疫后7 d，4种灭活疫苗均能有效抵抗兔病毒性出血性病毒的攻击，保护率均达到100%，而未免疫的对照组全部死亡；免疫后120 d，4种灭活疫苗的抗体滴度虽然已有所下降，但其保护率仍然可达到100%；免疫后180 d，4种灭活疫苗的保护率均下降，其中常规灭活疫苗的保护率最低达25%，蜂胶佐剂与铝胶佐剂可达到50%，黄芪多糖佐剂的保护率最高达75%。

表24种灭活疫苗攻毒保护结果（存活数/攻毒数）

处理7 d14 d28 d60 d120 d180 d蜂胶佐剂4/44/44/44/44/42/4黄芪多糖佐剂4/44/44/44/44/43/4铝胶佐剂4/44/44/44/44/42/4常规灭活疫苗4/44/44/44/44/41/4对照组0/40/40/40/40/40/4

3讨论

笔者利用实验室近期分离的强毒株分别研制了蜂胶佐剂、黄芪多糖佐剂、铝胶佐剂、生理盐水4种灭活疫苗，将4种疫苗进行比较，结果表明4种疫苗均具有良好的安全性，但免疫效果存在一定的差异，黄芪多糖佐剂灭活疫苗产生抗体最快，在免疫后7 d其抗体滴度可以达到7.50 log2，在免疫后14 d其血清抗体水平显著高于蜂胶苗和铝胶苗，且抗体维持时间较长，在免疫后180 d抗体效价仍可以达到5.75 log2，保护率达75%；铝胶佐剂灭活疫苗产生抗体较慢，免疫后7 d其抗体滴度达到6.25 log2，在免疫后28 d其血清抗体水平才达到黄芪多糖苗和蜂胶苗；常规灭活疫苗抗体水平维持时间较短，免疫后180 d其抗体效价已降到4.75 log2，保护率达25%；铝胶苗和蜂胶苗抗体维持时间较长，在免疫后180 d抗体效价分别为5.50 log2和5.25 log2，攻毒保护达50%。由此可见，黄芪多糖和蜂胶作为天然的免疫增强剂，具有一定的药理活性和保健功能，以其作为佐剂的RHDV灭活疫苗吸收快，抗体产生效价高且维持时间较长，是值得进一步推广应用的新型疫苗；常规灭活疫苗中的组织抗原成分可在短时间内被动物机体大量吸收，产生较高水平的抗体，但维持时间较短。铝胶佐剂由于抗原成分释放缓慢，产生高水平抗体所需时间较长，但其维持时间可与蜂胶佐剂相当。

该研究结果表明，当RHDV抗体效价为6.25 log2时，可以抵抗RHDV强毒的攻击；当抗体效价达5.75 log2时，不能完全抵抗RhDV强毒的攻击，初步确定了RHDV血凝抑制抗体效价和攻毒保护率之间的关系。该研究还表明RHDV灭活疫苗免疫4个月后4种疫苗的保护率均可达到100%，而免疫6个月后4种疫苗的保护率均没有达到100%，因此，确定RHDV的免疫期为4～6个月，绝对不能超过6个月，否则无法有效控制RHDV的发生与流行。

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