1株产胆红素氧化酶新菌株的分离与鉴定研究

黄世臣　赵敏

摘要[目的]分离与鉴定1株产胆红素氧化酶的新菌株。[方法]利用常规的微生物分离培养技术，从玉米叶片的病斑中分离出一株产胆红素氧化酶（bilirubin oxidase，BOD）的絲状真菌。[结果]通过形态学、生理学和rDNAITS（登录号为JN251106）序列分析，该菌株被鉴定为Bipolaris australiensis，命名为B.australiensis HD1，属子囊菌门格孢腔菌目格孢腔菌科平脐蠕孢属澳大利亚平脐蠕孢霉（B.australiensis），亦称澳洲双孢霉，是1株没有被报道过的具有产BOD的新产生菌；在不含任何诱导剂的发酵液中28 ℃，150 r/min，培养6 d，其酶活可达为1 000 U/L。[结论]该方法成功分离出1株产胆红素氧化酶的新菌株，为BOD的产生菌提供了新的微生物来源。

关键词胆红素氧化酶；Bipolaris australiensis；分离鉴定

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03486-05

基金项目中国国家林业厅984项目（2012-4-03）；自然科学基金（31170553，30671702，30170775）。

作者简介黄世臣（1973- ），男，吉林东辽人，副教授，从事环境微生物学的教学与研究。*通讯作者，从事环境微生物学的教学与研究。

胆红素氧化酶（EC 1.3.3.5）因其能催化胆红素氧化而得名，是由日本学者最早从丝状真菌（Myrothecium verrucaria）中分离并纯化出来[1]。现代研究表明，该酶属多铜氧化酶家族中一个成员。到目前为止，被文献报道的该酶微生物来源不足10种[2]，而被商业化生产的只有2种，分别为Myrothecium verrucarria和Trachyderma tsunodae。因该酶在医疗卫生[3-6]和生物燃料电池[7-11]领域具有巨大的应用潜力。从近5年来的文献数量上变化情况看，该酶现已逐渐成为多铜氧化酶家族中研究的热点。胆红素氧化酶与漆酶同属多铜氧化酶家簇成员，而漆酶远比胆红素氧化酶的物种报道的多（漆酶目前已被鉴定的有220种），但胆红素氧化酶具有漆酶无法比拟的特性，如在生理条件下稳定、对Cl-的高耐受性、高热稳定性、可专一氧化胆红素等可在生物燃料电池及医学临床诊断上被广为利用。基于此，笔者从环境中对产生该酶的微生物进行大量的筛选和鉴定研究，现报道如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。土壤样品，采自黑龙江省伊春市凉水国家级自然保护区的针叶阔叶混交林，吉林省长白山国家级自然保护区的针叶阔叶混交林，吉林省龙井市水稻田土壤；植物病害叶片样本由吉林农业大学农学院植物保护教研室白庆荣博士馈赠。

1.1.2主要仪器。UV2800紫外可见分光亮度计，购自尤尼柯（上海）仪器有限公司；Nikon ECLIPSE TE 2000E尼康倒置显微镜，购自日本尼康公司；Eppendorf centrifuge 5418离心机，购自Germany；纯水仪，购自MilliPore公司。

1.1.3主要试剂。胆红素结晶，购自Adamasbeta（Switzerland），吸光系数1 038 g/L（产家提供）；DNA凝胶回收试剂盒，购自北京庄盟公司；pMD18T载体，购自大连宝生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯或更高级纯品。

1.2方法

1.2.1溶液的配制。①培养基的制备。培养基配方见文献[12]，真菌分离培养基为查氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马丁氏培养基；细菌分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；真菌富集培养基为PDA；细菌富集培养基酵母提取物蛋白胨氯化钠琼脂培养基。真菌总DNA提取培养基为改良Mandels培养基[13]。②酶活测定缓冲液的配制。15 mmol/L TrisHCl pH 8.1，含1.0 mmol/L EDTANa2·2H2O，称取Tris base 1.815 g 溶于1 000 ml蒸馏水中，在37 ℃水浴中用浓盐酸调pH至7.4～7.6，加入0.336 g EATANa2·2H2O，充分溶解后备用。③胆红素溶液的配制。称取胆红素结晶2.0 mg，放入1.5 ml EP管中，加入0.5 ml无水甲醇，用枪吸打混匀，再逐滴加入预冷的0.2 mol/L无水碳酸钠溶液0.5 ml，用枪吸打混匀，置-20 ℃下备用5 d内使用。

1.2.2引物。①rDNAITS序列通用引物。ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′；ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′。②菌落PCR鉴定阳性转化子引物。M13：5′CGCCAGG GTTTTCCCAGTCAACGAC3′；RVM：5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′。以上所有引物均由大连宝生物工程有限公司合成。

1.2.3菌株的发酵培养及酶活检测。将来源于不同分离培养基中的培养物，依据外在性状的差异及时用接种钩或接种环以稀释涂布、单孢分离、平板划线等方法将其转移至另一装有相同培养基质的无菌平板中进行继代培养，经多次转接，获得其纯培养并编号，然后，通过富集培养获得大量的接种物，将分离富集的菌株分别恒温振荡培养。将培养后的菌悬液用离心的方法去除菌体，吸取上清作为粗酶液用于检测其是否产胆红素氧化酶。

每个三角瓶（250 ml）中加入培养基100 ml，121 ℃高压湿热灭菌20 min，待培养基冷却至室温后，接入适量的新鲜富集培养物，真菌以每个三角瓶中加入一块固态平板培养的接种物（菌落直径1 cm）；细菌以平板培养24 h的菌体用灭菌水5 ml稀释混均后吸取100 μl接种于三角瓶中发酵培养。真菌放于28 ℃的恒温振荡摇床120 r/min摇动6 d后检测酶活；细菌置于37 ℃的恒温振荡摇床120 r/min摇动2 d后检测酶活。

1.2.4胆红素吸收波长测定。取适量的胆红素晶体用1∶1（V/V）的甲醇和NaCO3（0.2 mol/L）溶液溶解后取20 μl与2.95 ml酶活测定缓冲液混均，吸入石英比色皿内，用酶活测定缓冲液调零后，在UV2102C/PC/PCS型分光亮度计上进行全波长扫描，扫描波长灵敏度设为1 nm。

1.2.5胆红素氧化酶的酶活定性及定量检测。①酶活定性检测。用移枪吸取2.5 ml缓冲液于小玻璃试管中，并将其置于37 ℃水浴中10 min预热；吸取经发酵培养液离心后所得上清0.5 ml放入小试管中，预热5 min后，加入胆红素溶液20 μl（2 mg/ml），观察溶液的颜色是否变绿，变绿者为产生胆红素氧化酶的菌株。②酶活定量检测。在37 ℃条件下，氧化1 μmol胆红素所需要的酶量定义为一个酶活。

1.2.6形态学鉴定。①菌落形态显微鉴定。将产生胆红素氧化酶的菌株接种于PDA平板上，倒置于28 ℃恒温培养箱内培养7 d后观察菌落形态。②菌丝形态显微鉴定。挑取在PDA培养基上培养4 d后的新生菌丝体少许，置于含有浮酚油的载玻片上，用解剖针小心将菌丝分开，在倒置显微镜下观察菌丝的颜色、隔膜有无等。③分生孢子和分生孢子梗显微形态鉴定。将菌株接种于水洋菜-麦杆培养基中，于20 ℃、360 nm近紫外灯照射，12 h光照、12 h黑暗交替培养。每24 h镜检观察一次菌落大小、颜色，分生孢子的大小、数量、隔膜产生等。

安徽农业科学2014年1.2.7生理学鉴定。①分生孢子隔膜形成次序。将目标菌株在PDA培养基上培养5～7 d后，剥去菌落的表面气生菌丝，用挑针挑取带有培养基直径为1 cm的菌块放于培养皿中的滤纸上（含有内含3～5层滤纸，事先用灭菌水将其湿透），置于20 ℃下放置6 d后镜检，以后每隔1～2 h观察1次。②分生孢子萌发方式。取一洁净的载玻片，将滤纸片剪成与其大小相近的纸片，同时在滤纸片的中央处剪一边长约为0.5 cm的正方形小孔，用水湿润滤纸后将其附着于载玻片上，然后将此载玻片放入培养皿内，培养皿内事先放置3层滤纸并用灭菌水浸润，用报纸将培养皿包好后高压灭菌。待培养皿温度降至室温后，取培养5 d的PDA平板用接种钩挑取一定量的菌体（含有菌丝和分生孢子）均匀得涂布在正方形滤纸周围，置于28 ℃上恒温培养，每隔24 h镜检一次。③分生孢子在分生孢子梗上的产孢方式。处理方法同“②”，保湿培养2～4 d后镜检。④最适生长温度。菌株在PDA平板上培养5 d，在无菌条件下，用灭菌的打孔器（直径0.5 cm）将菌落切割为大小一致接种体，将其接种于PDA平板中央，每一平板接种一块接种体，28 ℃恒温条件下倒置培养24 h后，将平板分别置于5、25、28、30、35和40 ℃恒温条件下倒置培养3 d测量菌菌直径；每处理3次平行。⑤最适生长pH值。配PDA培养基，在加入琼脂前等待培养基温度降至室温后调pH值，pH设置为4、5、6、7、8、9和10，分别加入琼脂后高压灭菌。接种后，28 ℃恒温倒置培养108 h后测量菌落直径；每处理3次平行。

1.2.8分子鉴定——rDNAITS序列分析。①真菌基因组DNA提取。用改进的CTAB法提取真菌染色体DNA[12]。②ITS序列扩增。真菌ITS序列通用引物[13]为ITS1和ITS4；PCR反应体系及反应程序见表1和表2，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。③目的片段的纯化。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切取含有目的片段的胶块转移至1.5 ml EP管中，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。④目的片段的克隆与转化。取纯化的PCR产物2 μl，按说明书上的方法与pMD18T载体连接3 h后，将连接物转化至高效感受态E.coli JM109细菌细胞中，并将其置于LB液体培养基37 ℃、200 r/min振荡培养1 h，取100 μl转化菌液，均匀地涂在含Xgal、IPTG和Amp的LB平板上，并设不含Amp的LB平板作对照，37 ℃培养12～16 h。⑤重组子筛选与鉴定。随机挑取7个白斑菌落分别接种于1.0 ml LB培养基中，200 r/min，培养4 h，取2 μl作为菌落PCR的模板；PCR反应体系及反应程序见表3和表4；取4 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。⑥rDNAITS序列测定与分析。将确定为阳性克隆的菌液送上海生物工程公司进行测序。在测序结果中找到目的序列在NCBI数据库中进行同源性比對，下载相关序列，采用Mega5.1软件对序列进行亲缘性及系统发育分析。

2结果与分析

2.1胆红素的最大吸收波长测定图1表明，胆红素在440 nm处有最大吸收峰，因此试验中胆红素氧化酶的酶活测定波长选定在440 nm处。

2.2形态学鉴定通过对不同来源的土壤样品和植物叶片

邻接法建树程序建系统发育树（图10）。对比结果显示，HD1菌株与Bipolaris sp.，Cochliobolus geniculatus，Pleosporaceaesp.，Dothideomycete sp.，Bipolaris papendorfii和Pleosporaceae sp.6株菌物有100%的同源性，但序列间的自展支持率却不高（低于65%）。邻接树中的Cochliobolus geniculatus为cynodontis的同种异名。Cochliobolus属为Bipolaris属的有性型，在试验中未发现其有性型。系统发育树的结果表明，研究所提交的序列在NCBI库中的比对结果只能提供种属鉴定的部分分类鉴定信息，最终的种属鉴定有必要结合形态学和生理学方面的数据支持。

结合形态学，生理学和rDNAITS序列分析结果及文献信息[14]，菌株HD1被鉴定为Bipolaris australiensis。注：标“*”为研究提交序列；括号内字母及数字为基因登录号；标尺代表序列间差异为0.5%；节点处数字为自展值。

圖10邻接法建菌株HD1系统发育树3结论

试验从患病玉米叶片中分离出1株产胆红素氧化酶的真菌菌株，通过形态学、生理学和rDNAITS序列分析，该菌株被鉴定为Bipolaris australiensis，命名为B.australiensis HD1，属子囊菌门格孢腔菌目格孢腔菌科（Pleosporaceae）平脐蠕孢属（Bipolaris）澳大利亚平脐蠕孢霉（Bipolaris australiensis），亦称澳洲双孢霉，是一株没有被报道过的具有胆红素氧化酶酶活性的新菌株，该菌物在无诱导剂存在下，28 ℃、150 r/min恒温摇床培养6 d后，酶活可达1 000 U/L，为胆红素氧化酶的产生菌提供了新的微生物来源。

参考文献

[1] MURAO S，TANAKA N.A New enzyme bilirubin oxidase produced by Myrothecium verrucaria Mt1[J].Agric Biol Chem，1981，45（10）：2383-2384.

[2] MANO N.Features and applications of bilirubin oxidases[J].Appl Microbiol Biotechnol，2012，96（2）：301-307.

[3] PERRY B，DOUMAS B T，BUFFONE G，et al.Measurement of total bilirubin by use of bilirubin oxidase[J].Clin Chem，1986，32（2）：329-332.

[4] YUNO T，YAMAMOTO Y，NAKAMURA H.Determination of unbound bilirubin by the new enzyme “bilirubin oxidase”[J].Rinsho Byori，1986，34（3）：297-302.

[5] DOUMAS B T，PERRY B，JENDRZEJCZAK B，et al.Measurement of direct bilirubin by use of bilirubin oxidase[J].Clin Chem，1987，33（8）：1349-1353.