温差—超声波复合法破壁山茶蜂花粉的研究

刘功良 马磊 唐汉良 陈嘉玲 白卫东

摘要 [目的]优化温差-超声波复合法破壁山茶蜂花粉的工艺条件。[方法]以山茶蜂花粉为原料，采用温差并结合超声波辅助的复合破壁法对山茶蜂花粉进行破壁，使花粉破碎，释放出内容物。利用单因素试验和正交试验方法研究温差破壁和超声波破壁的最佳试验条件。[结果]试验获得温差破壁最佳试验条件如下：温差100 ℃，料液比1∶7 g/ml，冷冻时间24 h，水浴时间5 h，水浴温度45 ℃。在此条件下测得破壁率为68.75%，可溶性总糖的含量为40.02%，游离α.氨基氮的含量为3.58%。对温差处理过的样品进行超声波辅助破壁的最优工艺为：在超声10 min的情况下，测得破壁率为72.41%，可溶性总糖含量为46.08%，游离α.氨基氮含量为3.81%。[结论]该方法破壁效果比较好、成本低、可用于小规模生产。

关键词 山茶蜂花粉；破壁；温差；超声波

中图分类号 S896.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05233-03

蜂花粉是蜜蜂采集植物的花粉加上蜜蜂自身的腺上分泌物、唾液和花粉形成的不规则扁圆形团状物。它不仅含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质、酶类，还含有对人体生理功能具有特殊功效的核酸、黄酮等生物活性物质[1-2]。但花粉有坚韧的细胞壁，对胃酸和消化系统酶为非常穩定的理化特性[3]，这样既影响了营养成分的吸收利用，也阻止了提取时营养物质的释放，因此蜂花粉的破壁及破壁方法尤为重要[4-5]。茶花粉具有特殊的茶香气息，味道微甜，呈橘红色，微碱性，凉爽无毒。它富含蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素、活性酶等多种有效活性成分[6-7]，山茶蜂花粉外壁不易被胃肠道消化，必须进行特殊的破壁处理才能使营养成分大量释放出来，被人体消化吸收。

蜂花粉细胞“破壁”是指对蜂花粉单细胞的细胞壁及其萌发孔进行整体破坏或仅破坏萌发孔的闭锁点。花粉细胞会受到不同程度的损伤，花粉内含营养物质释放出来，以利于人体吸收和利用[8-9]。笔者以山茶蜂花粉为原料，利用单因素试验和正交试验方法研究温差破壁和超声波破壁的最佳试验条件，使花粉破碎，释放出内容物。

1 材料与方法

1.1 材料 供试山茶蜂花粉由广州蜂唛蜂业有限公司提供。主要试剂：葡萄糖（分析纯），广州一马环保科技有限公司；甲醛溶液（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；98%浓硫酸（分析纯），广州化学试剂；蒽酮试剂（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 破壁率、可溶性总糖、游离α.氨基氮的检测

1.2.1 破壁率的计算方法。采用破壁方法处理后，取混悬液制片，镜检。镜检计算时，使用生物显微镜10×20放大倍数，机械推进定位5个视野，记录破壁蜂花粉粒总数目和完整蜂花粉粒数目[10]。计算公式：

破壁率%=已破壁花粉粒数/观察花粉总粒数×100

1.2.2 蒽酮比色法测定可溶性总糖。葡萄糖标准曲线的制作：吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6 ml标准葡萄糖工作液，置入25 ml比色管中，并补水至2.0 ml，加6.0 ml蒽酮试剂，于沸水浴加热5 min，冷却，波长620 nm，1 cm比色皿，0号管为空白，测定吸光度，以葡萄糖量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。

可溶性总糖的测定：将水浴完的山茶花粉液体在5 000 r/ min下离心5 min，取5支25 ml比色管，分别加入0.125 ml不同温差的上清液，定容至25 ml，即稀释200倍。再从稀释了200倍的液体中分别吸取1 ml加入到另5支比色管中，定容至10 ml，即一共稀释了2 000倍。取5支试管，标记为1、2、3、4、5，分别加入对应温差的稀释液2.0 ml，再分别加入6.0 ml蒽酮试剂，沸水浴5 min，冷却，测吸光值。计算公式：

式中，m为由吸光值查得对应的葡萄糖的含量（μg），a为从总样品液中取0.125 ml上清液相差的倍数，M为蜂花粉的质量（g）。

1.2.3 甲醛滴定法测定游离α.氨基氮。游离α.氨基氮的测定：吸取0.5 ml上清液，加25 ml去离子水，3滴酚酞试剂，摇匀后用0.01 mol/L的NaOH标准溶液滴至微红。再加入10 ml中性甲醛溶液，静置片刻，再用0.01 mol/L的NaOH标准溶液滴定回到微红色终点，记下甲醛加入后样品消耗NaOH标准溶液的体积。同样，取25.5 ml水按以上操作做空白试验。计算公式：

式中，V为加入甲醛后样品消耗的NaOH标准液的体积（ml），C为NaOH的浓度（ mol/L），0.014为消耗1 ml 1 mol/L NaOH标准液相当于氮的质量（g），0.5为取离心后的上清液0.5 ml，b为蜂花粉与去离子水混合后的体积（0.1 ml），m为花粉的质量（g）。

1.3 方法

1.3.1 温差对山茶蜂花粉破壁的影响。将5小袋5 g经过研磨的蜂花粉，置于-18 ℃的冰箱中24 h。在相同的料液比（1∶5 g/ml）、水浴温度（45 ℃）、水浴时间（5 h）下，考察70、80、90、100、110 ℃[11]这5种不同温差下山茶蜂花粉的可溶性总糖和游离α.氨基氮的含量，并计算最佳温差条件下的破壁率。

1.3.2 料液比对山茶蜂花粉破壁的影响。将5小袋5 g经过研磨的蜂花粉，置于-18 ℃的冰箱中24 h。在100 ℃的温差下，分别以1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11 g/ml的料液比进行解冻，然后置于45 ℃的水浴锅中水浴5 h[12]。测定不同料液比下蜂花粉的可溶性总糖和游离α.氨基氮的含量，并计算最佳料液比下的破壁率。

1.3.3 水浴时间对山茶蜂花粉破壁的影响。称取5小袋5 g经研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中冷冻 24 h，用 82 ℃（温差100 ℃）的热水以1∶5 g/ml 的料液比进行解冻，再于45 ℃水浴温度下分别水浴 4、5、6、7、8 h，检测不同水浴时间下蜂花粉的可溶性总糖和游离α.氨基氮的含量，并计算最佳水浴时间条件下的破壁率。

1.3.4 冷冻时间对山茶蜂花粉破壁的影响。称取5小袋5 g经研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中分别冷冻6、12、24、36、48 h，用 82 ℃（即温差100 ℃）的热水以 1∶5 g/ml的料液比进行解冻，再于45 ℃水浴温度下水浴 5 h，检测不同冷冻时间下蜂花粉的可溶性总糖和游离α.氨基氮，并计算最佳的冷冻时间下的破壁率。

1.3.5 水浴温度对山茶蜂花粉破壁的影响。将5小袋5 g经过研磨的蜂花粉，置于 -18 ℃的冰箱中冷冻 24 h，用 82 ℃（温差100 ℃）的热水以 1∶5 的料液比进行解冻，再于30、35、40、45、50 ℃这5个水浴温度下水浴5 h，检测不同水浴温度下蜂花粉的可溶性总糖和游离α.氨基氮的含量，并计算最佳水浴温度下的破壁率。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖的标准曲线 试验得葡萄糖标准曲线见图1。

2.2 温差对山茶蜂花粉破壁的影响 由图2可得，选择 100 ℃ 为适宜温差。在此温度下算得可溶性总糖含量为27.8%，游离α.氨基氮的含量为2.86%。在此条件计算破壁率，在显微镜下观察到山茶蜂花粉粒总数为46，破壁蜂花粉粒数为31，由此算得破壁率为67.39%。

图2 温差对山茶蜂花粉破壁的影响2.3 料液比对山茶蜂花粉破壁的影响 由图3可知，选择1∶5 g/ml为最佳的料液比。测得可溶性总糖含量为30.59%，游离α.氨基氮含量为2.35%。在显微镜下观察得到花粉粒总数为51，破壁花粉粒数为35，算得破壁率為68.63%。

2.4 水浴时间对山茶蜂花粉破壁的影响 由图4可知，选择5 h为最佳水浴时间，测得吸光值为0.215，算得可溶性总糖含量为27.1%，游离α.氨基氮含量为2.43%。通过此条件计算破壁率，在显微镜下观察得到花粉粒总数为49，破壁花粉粒数为33，算得破壁率为67.34%。

2.5 冷冻时间对山茶蜂花粉破壁的影响 由图5可知，以冷冻时间为24 h最佳。在此冷冻条件下，可溶性总糖含量为27.62%，游离α.氨基氮含量为2.35%。通过此条件计算破壁率，在显微镜下观察得到花粉粒总数为44，破壁花粉粒数为30，算得破壁率为68.18%。

2.6 水浴温度对山茶蜂花粉破壁的影响 由图6可得，选择45 ℃为最佳水浴温度。测得可溶性总糖含量为38.07%，游离α.氨基氮含量为3.02%。通过此条件计算破壁率，在显微镜下观察得到花粉粒总数为51，破壁花粉粒数为35，算得破壁率为68.63%。

2.7 正交试验结果分析 在单因素试验的基础上，选取温差、料液比、水浴时间、冷冻时间、水浴温度各因素的最优试验范围，按照表1的因素水平表，选择L16（53）正交表进行正交优化试验，根据可溶性总糖、游离α.氨基氮的大小情况，确定检测温差破壁的最佳试验条件。结果分析见表2所示。

从正交试验结果可以看出，试验的最优因素水平组合为A2B3C2D2E2，即选择温差为100 ℃，料液比为1∶7 g/ml，水浴时间为5 h，冷冻时间为24 h，水浴温度为45 ℃作为接下来进一步试验研究的反应条件，并测得在此条件下的破壁率为68.75%。

2.8 超声波时间对山茶蜂花粉破壁的影响 将以最佳温差破壁条件处理过的茶花粉进行超声处理，所用仪器为超声波清洗机，超声波功率为220 W，对超声时间进行单因素考察。

由图7可得，超声10 min时的可溶性总糖含量、游离α.氨基氮含量为最高，随后逐渐降低并走向稳定。所以选择10 min为最佳超声波时间。在此超声波条件下，可溶性总糖含量为46.08%，游离α.氨基氮含量为3.81%，在显微镜下观察得到破壁蜂花粉粒数为42，蜂花粉总粒数为58，算得破壁率为72.41%。

3 结论

该研究根据单因素设计正交试验，得出温差破壁的最佳条件为温差100 ℃，料液比1∶7 g/ml，水浴时间5 h，冷冻时间24 h，水浴温度45 ℃。然后超声处理10 min，破壁率为72.41%，可溶性总糖含量为46.08%，游离α.氨基氮含量为3.81%。

通过试验验证，此方法破壁效果比较好，可用于小规模生产。超声波辅助技术是利用朝身边辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应加速物质的扩散溶解，该技术的低温作用有利于保留热敏成分、成本低、容易实现产业化等优点。

参考文献

[1] 徐景辉，庄元忠.蜂蜜花粉研究与利用[M].北京：中国医药科技出版社，1991：1-3.

[2] 王开发，潘建国，支崇远.花粉多不饱和脂肪酸研究与展望[J].食品科技，2002（7）：68.

[3] BLACKMORE S， WORTLEY A H， SKVARLA J J， et al. Pollen wall development in flowering pants[J]. New Phytologist， 2007， 174（3）： 483-498.

[4] 任向楠，张红城，董捷.蜂花粉破壁的研究进展[J].食品科学，2009，30（21）：380-383.

[5] 王娟，余少文.花粉的营养成分/结构及破壁方法[J].食品研究与开发，2007，28（8）：150-152

[6] 余勃，陆豫，郑颖洁.茶花粉超微粉碎破壁工艺优化[J].食品科学，2009，30（22）：88-91.

[7] KROYER G， HEGEDUS N. Evaluation of bioactive properties of pollen extracts as functional dietary food supplement[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies，2001（2）：171-174.

[8] 倪辉，蔡慧农，吴黎明.利用蒸汽爆破法破壁花粉的技术[J].农业工程学报，2010，26（5）：367-371.

[9] XU X，SUN L P，DONG J， et al. Breaking the cells of rape bee pollen and consecutive extraction of functional oil with supercritical carbon dioxide[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009（10）： 42-46.

[10] 李丽，刘晔玮，赵剑喜，等.高速剪切技术破碎油菜蜂花粉细胞壁工艺[J].食品科学，2012，33（12）：97-101.

[11] 杨芙莲，党云刚.温差-超声波复合花粉破壁工艺的研究[J].食品科技，2010，35（3）：94-97

[12] 吴玲，陈新建，张列峰，等.松花粉湿法破壁工艺研究[J].食品工业科技，2009（4）：213-215.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：5246-5247，5275

责任编辑 李菲菲 责任校对 况玲玲