不同消毒方式对华中枸骨组织培养的影响

范淑芳

摘要 [目的]考察不同消毒方式对华中枸骨组织培养的影响。[方法]以华中枸骨的带芽新梢茎段为外植体，分顶芽和侧芽，研究乙醇、升汞的作用时间以及吐温的用量对外植体消毒的影响。[结果]华中枸骨新梢顶芽的最佳消毒方式为：浓度75%乙醇作用50 s，浓度0.1%升汞作用6 min，Tween.80 1滴；侧芽的最佳消毒方式为：浓度75%乙醇作用50 s，浓度0.1%升汞作用7 min。[结论]该方法优化了华中枸骨组织培养的消毒方法，为华中枸骨的进一步开发利用提供依据。

关键词 华中枸骨（Ilex centrochinensis）；组织培养；消毒方式

中图分类号 S181.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05007-02

华中枸骨（Ilex centrochinensis）为冬青科（Aquifoliaceae）冬青属（Ilex）植物，又称针齿冬青或小果冬青。该植物寿命长，枝叶繁茂，茎枝形态多变且叶形奇特，叶上荆刺长短对称，碧绿常青且黄花红果，是一种应用于建造庭院、楼台美化、盆景造型、公园观赏及寺庙仿古等的最佳天然植物材料之一；此外，该植物富含多种营养元素，可药、茶两用，且品质优良，是集观赏与保健功能为一体的优质植物资源，故又被形象地称为苦荆茶[1]。该植物种子繁殖与扦插繁殖均比较困难，其组培快繁的研究鲜有报道，严重限制了其推广应用。笔者主要针对带芽新梢茎段的消毒方法展开系统地试验，以期找到最佳的消毒方法，减少无菌系建立中的损失，为其组培快繁服务[2-4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。华中枸骨（Ilex centrochinensis），来源于湖北省黄冈市，于4月初采取长约5～10 cm、未木质化的新梢茎段作为外植体。

1.1.2 主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒方法。将华中枸骨新梢修剪好后分顶芽和侧芽各冲洗3遍、加洗衣粉水洗振荡5 min、自来水冲洗1.5 h，再分别按表1正交设计表Lg（34）进行4因子3水平消毒处理，处理顺序为：无菌水1遍，浓度75%乙醇，无菌水1遍，浓度0.1%升汞与吐温同时加入，无菌水清洗5～6遍，每次3 min[5]。消毒后处理后每瓶竖接一个带芽茎段，长约1 cm，顶芽每处理10瓶，重复3次，侧芽每处理30瓶，重复3次。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒时间的确定

2.1.1 顶芽消毒时间的确定。由表2可知，华中枸骨新梢顶芽的消毒处理中，消毒效果之间的差异达到极显著（P<0.01），浓度75%乙醇40 s，浓度0.1%升汞5 min，Tween.80 1滴的消毒效果较好。而就后期生长而言，浓度75%乙醇50 s、浓度0.1%升汞6 min、Tween.80 1滴的消毒处理对芽的形成与生长作用较好；浓度75%乙醇30 s、浓度0.1%升汞5 min的消毒处理则对愈伤的形成与生长较好。

2.1.2 侧芽消毒时间的确定。由表3可知，华中枸骨新梢侧芽的消毒处理中，消毒效果之间的差异达到极显著（P<0.01），75%乙醇50 s、0.1%升汞7 min的消毒效果较好；而就后期生长而言，75%乙醇50 s、0.1%升汞7 min的消毒处理对芽的形成与生长作用较好，75%乙醇40 s、0.1%升汞6 min的消毒处理则对愈伤的形成与生长较好。

2.1.3 外植体中顶芽与侧芽的差异。由表2、3相比较可知，外植体中顶芽与侧芽所确定的较好的消毒处理方法不一致，见图1，侧芽不同消毒处理效果的变化趋势要较顶芽平缓，说明不同的消毒处理对顶芽的消毒作用较侧芽强；顶芽培养1个月后芽的萌动率明显高于侧芽，其不同消毒处理之间的芽萌动率的差异见图2，其最大可相差83.84%（消毒处理5），说明顶芽比侧芽更易于诱导芽的发生；顶芽愈伤的萌动率则明显低于侧芽；无变化的侧芽也比无变化的顶芽的比率大。综合考虑，如果以带芽茎段诱导不定芽的方式来进行华中枸骨的组织培养和快速繁殖，顶芽明显比侧芽好，应优先选择新梢顶芽作为外植体。

3 结论与讨论

试验结果表明，华中枸骨以带芽的新梢茎段作为外植体进行消毒处理时，华中枸骨新梢顶芽的最佳消毒方式为：浓度75%乙醇作用50 s，浓度0.1%升汞作用6 min，Tween-80 1滴；侧芽的最佳消毒方式为：浓度75%乙醇作用50 s，浓度0.1%升汞作用7 min。春季萌条中顶芽的芽萌动率明显比侧芽高，无变化的茎段所占的比例也比侧芽低，消毒处理中的死亡率则比侧芽高，可能原因为顶芽的生长势较侧芽强，且顶芽较侧芽幼嫩。

参考文献

[1] 李树文.苦荆茶[J].特产研究，1991（1）：31，45.

[2] 肖显华，王顺珍，林荣双，等.植物材料表面消毒方法的改进[J].生物技术，1999，9（1）：43-45.

[3] 王利民，周毅，陈龙友，等.植物组织培养中消毒剂的运用[J].贵州师范大学学报：自然科学版，2002，20（1）：15-17.

[4] 朱广廉.植物组织培养中的外植体灭菌[J].植物生理学通讯，1996，32（6）：444-449.

[5] 孟玉玲，谷祝平.正交設计在诱导植物体细胞胚胎发生中的应用[J].西北植物学报，1995，15（1）：10-15.