不同碳源、氮源对蜜环菌生长的影响

任思竹 陈青君 程继鸿

摘要 [目的]研究碳源、氮源对蜜环菌生长的影响。[方法]选用6种不同碳源和8种不同氮源的培养基，通过测定摇瓶浅层培养后蜜环菌菌球的生物量，探讨不同的营养源对蜜环菌生长的影响。[结果]最佳的培养条件为：在培养温度25 ℃、振荡器转速为150 r/min的黑暗环境中恒温培养10 d；最适碳源、氮源分别是蔗糖和酵母膏，菌球生物量分别达到（10.60±2.70）和（3.95±3.55） g/L。[结论]该方法为供试蜜环菌的培养基筛选及进一步研究天麻、猪苓的共生特性提供了理论基础。

关键词 浅层培养；蜜环菌；营养源；生物量

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-04974-04

蜜环菌[Armillaria mellea （Vahl ex Fr.）Quel]是一种药（食）用菌[1]，与药用植物天麻[2]（Gastrodia elata Bl）和真菌猪苓（Grifola umbellate）相伴生[3]。1790年Vahl首次鉴定蜜环菌，研究表明蜜环菌可以引起多种针叶、阔叶树木的根腐病，寄主植物多达300属之多[4]，現已发现蜜环菌共34种，其中欧洲分布5种，非洲2种，北美7种，澳大利亚5种，日本6种，中国记载有9种[5]。蜜环菌药用价值大，有预防失眠[6]、抗惊厥[7]、抗衰老[8]、抗肿瘤[9]等功效。

蜜环菌同大多数微生物类似，在不同的碳源下，呼吸途径不同，产能也不相同[10]。由菌丝体形成菌索是蜜环菌的一个重要特征。试验试图在基础培养基中添加相同碳含量的糖和相同氮含量营养物质对蜜环菌菌索生长的影响，通过测量蜜环菌菌球生物量和直径等参数，以期为供试蜜环菌在培养基筛选及进一步研究天麻、猪苓的共生特性提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。蜜环菌8号，由北京农学院植物科学技术学院自行分离，保存于0～4 ℃的木屑培养基中。

1.1.2 主要试剂。供试碳源分别为葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖和淀粉；供试氮源分别为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵和碳酸氢铵，市售。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及液体一级菌种的制备。①菌种活化。将保存的木屑菌种接种在PDA培养基平板上进行一次活化，于27 ℃恒温培养箱中黑暗培养15 d，当菌落长满培养皿后使用。②液体1级菌种。于500 ml三角瓶中装入200 ml去除琼脂后的PDA液体培养基，灭菌冷却后接种体积约0.1 cm2培养皿母种 3～5块后，于黑暗25 ℃，150 r/min摇床上振荡培养10 d。

1.2.2 碳源液体培养基制备。①基础培养基。去皮马铃薯200 g煮汁、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、水1 000 ml、pH值自然。②供试碳源培养基。保持培养基中碳含量等量，分别在基础培养基中加入葡萄糖20 g，果糖20 g，蔗糖31.64 g，麦芽糖33.32 g、乳糖31.65 g，淀粉29.96 g，制成不同的碳源培养基，200 ml液体装入500 ml的摇瓶中，3次重复。

1.2.3 氮源液体培养基制备。①基础培养基。PDA培养基。②供试氮源培养基。保持培养基中氮含量相等，即每升基础培养基中加入蛋白胨34.48 g，牛肉膏38.46 g，酵母膏78.12 g、尿素10.72 g、硫酸铵23.59 g、硝酸铵14.29 g、氯化铵19.10 g、碳酸氢铵28.21 g。

1.2.4 灭菌冷却。透气膜和牛皮纸封口后灭菌（121 ℃，30 min，0.101 MPa），冷却后接种。

1.2.5 接种及培养方法。用已准备好的液体1级菌种，倒入灭菌彻底的小烧杯中20 ml，转接于各摇瓶中，置于25 ℃的恒温摇床中（相对湿度70%，150 r/min，黑暗）培养10 d待测。

1.2.6 测量。①菌球直径。将100目的细胞筛过滤发酵液，在称量纸上随机挑取10个菌球紧密排成一排，刻度尺测量总长度，计算出菌球平均直径，每个处理3次重复。②生物量干重。将液体培养基中菌丝球全部滤出，于80 ℃烘干24 h后称重。

1.2.7 试验数据分析。将所得数据按不同的培养基成分整理，采用DPS V7.5软件进行分析， 方差分析采用Duncan新复极差法处理，大写字母表示达到1%极显著水平差异，小写字母表示达到5%显著水平差异。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对蜜环菌生长的影响 由表1～2综合分析可知，6种碳源均可被蜜环菌利用，但能力存在差异。其中以蔗糖为碳源，蜜环菌菌球生物量最大，达到10.60 g/L，同其他糖类相比有着极显著优势（P<0.01）；其次是可溶性淀粉，达到3.45 g/L，葡萄糖和果糖二者之间存在差异不明显（P>0.05），菌球生物干重分别为2.50和2.45 g/L；乳糖较差，菌球生物干重1.95 g/L；麦芽糖菌球生物干重最小，仅为1.20 g/L，以菌球生物量为指标，摇瓶浅层培养基中最适宜碳源是蔗糖。菌球直径小，单位体积内的菌丝球数就会越多，接种时萌发点多有利于下一级的扩繁，在各种糖原中蔗糖的直径最小，为0.22 cm，并且其成本也很低，所以最适碳源最终确定为蔗糖。

2.2 不同氮源对蜜环菌菌球生物量的影响 将蜜环菌菌种在不同的氮源下培养，由表3～4可知，蜜环菌均可利用试验设计的8种氮源，但在不同氮源培养基的影响下，蜜环菌的菌丝球生长存在显著差异（P<0.05）。其中酵母膏和蛋白胨为氮源，菌球生物量干重最大，分别达到3.95和3.85 g/L，二者之间无显著差异（P>0.05），但与其他处理间存在差异（P<0.05）；牛肉膏和氯化铵的菌丝生物干重分别为3.00和2.00 g/L，硝酸铵、硫酸铵、尿素3种氮源无显著性差异（P>0.05），生物量均较少。以碳酸氢铵为氮源的菌丝生物量最小，仅为0.25 g/L，与其他培养基相比相差较远。以菌丝生物量为指标，浅层培养蜜环菌最好的氮源是酵母膏和蛋白胨，但考虑到酵母膏成本偏高，菌球（0.28 cm）较蛋白胨的直径（0.18 cm）大，建议小规模试验选择酵母膏作氮源，而在工业化生产中进行继代培养时选蛋白胨更优（图1）。

3 结论与讨论

蜜环菌是天麻、猪苓等赖以生存的支柱，好的蜜环菌菌种除与菌株本身的遗传特性有关外，还依赖于培养环境和培养基质所提供的养分，只有在比较充足的营养环境下，生理功能才能正常完成，性状才能得以稳定的表达[11]。碳源、氮源是最基本的生长因子[12]，碳源构成菌体细胞，提供能量来源；氮源为合成蛋白质和核酸不可或缺的原料[13]。只有筛选出最适碳源、氮源，才可以为获得较高菌丝生物量。试验以蜜环菌菌球干重为主要指标，菌球直径为辅助指标，筛选出了适合北农8号蜜环菌生长的碳源为蔗糖，氮源为酵母膏和蛋白胨。试验数据充分表明，蜜环菌种类、来源不同对营养条件的要求也有所不同，对不同碳源、氮源的利用有着较大差异。程显好等研究认为，甘露醇是最适宜的碳源，而刘天贵和胡尚勤的研究表明葡萄糖为最佳碳源，也有认为蛋白胨、酵母膏为最佳氮源的报道[14]。

此外，在进行对比试验时，曾将蜜环菌作为培养皿固体或半固体培养基质进行试验，通过观测蜜环菌在固体或半固体内菌索的干重、长速、满皿时间等指标，但其生长周期较长，辨识度较低。相对比，液体浅层培养的方法操作更为简单，结果更可靠，效果更明显，并且大大的节省了去除琼脂等繁文缛节性的工作。在进行培养皿内固体碳源的比较时发现，各种碳源培养基长势都过于缓慢，获得纯净菌索的差异较小，对比度不大；在氮源比较中，与蜜环菌在摇瓶培養中得到的结果基本一致，所以最终的结论确定为蜜环菌在以蛋白胨为氮源做培养基的情况下，最适宜生长，而对于不同营养因子之间的合理搭配等研究，需要在后续设计正交试验才可以确定。

参考文献

[1] 陈楠.蜜环菌的化学成分及生物活性研究[D].长春：吉林农业大学，2012：1.

[2] 李春红.天麻高产栽培技术[J].河南农业，2013（12）：12.

[3] 王秋颖，郭顺星，樊锦艳.不同蜜环菌菌株生物学特性及菌丝体多糖含量的研究[J].中国药学杂志，2001，36（9）：588-590.

[4] 程显好，刘林德，董洪新，等.蜜环菌菌丝体液体培养条件的优化[J].中药材，2007（5）：509-511.

[5] 熊鹰，姜邻，唐利民.蜜环菌母种培养基筛选试验[J].中国食用菌，2004，23（5）：25-26.

[6] 徐锦堂，冉砚珠.中国天麻栽培学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：1-294.

[7] 中国医学科学院药物研究所药理室新药组.天麻水剂及蜜环菌发酵液对神经系统的药理作用[J].中华医学杂志，1997（8）： 470-472.

[8] 丁诚实，沈业寿，彭世奇.蜜环菌壳聚糖对果绳寿命和D-半乳糖致衰老小鼠的影响[J].食品科学，2007， 28（4）： 302-305.

[9] 华晓燕.蜜环菌多糖对SMMC-7721肝癌细胞抑制及促凋亡作用的研究[D].佳木斯：佳木斯大学，2006.

[10] 王毓仁.提高废水生物反硝化效果的理论和实践[J].石油化工环境保护，1995（2）：1-7.

[11] 王振河，武忠伟，赵现方，等.营养物质对桑黄菌丝生物量及胞外多糖产量的影响[J].中国野生植物资源，2009，28（1）：39-40.

[12] 周德庆.微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2002：82-86.

[13] 秦俊哲，吕嘉朽.食用菌贮藏保鲜与加工新技术[M].北京：化学工业出版社，2003.

[14] 彭述敏，陈玉惠，程立君，等.2株优良天麻共生蜜环菌生长条件筛选[J].中国食用菌，2010，29（4）：22-25.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：4991-4992，5008

责任编辑 姜丽 责任校对 况玲玲