1株咪草烟高效降解菌的筛选及鉴定

保永明　刘念　张琪慧　何佳遥　董爱荣

摘要 [目的]筛选对咪草烟具有降解作用的高效乡土菌株。[方法]对采自黑龙江省哈尔滨市郊区的对咪草烟具有降解作用的多种菌株进行了分离、筛选及鉴定。[结果]筛选得到3株菌： CX白、CX红和CX黄，其降解率分别为 58.98%、38.82% 和13.19%，其中降解效果最好的CX白属于革兰氏阳性的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。[结论]为咪草烟高效降解菌的田间实际应用和产业化生产提供了参考。

关键词 咪草烟；降解菌；高效液相色谱；鉴定

中图分类号 S482.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06707-02

Screening and Identification of One Efficient Imazethapyrdegrading Bacterium

BAO Yongming，DONG Airong et al

（Northeast Forestry University，Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to screen one efficient imazethapyrdegrading bacterium. [Method] Some imazethapyrdegrading bacterium strains which were collected from Harbin suburb of Heilongjiang were isolated， screened and identified. [Result] Three degradation strains were selected， containing CXwhite， CXred and CXyellow. The degradation rates of CXwhite， CXred and CXyellow were 58.98%， 38.82% and 13.19%， respectively. Using the DNAExtracted kit， the DNA of CXwhite were extracted and amplified by PCR. The CXwhite which could degrade imazethapyr efficiently belonged to Bacillus sp. [Conclusion] The research results lay theoretical basis for field application and industrial production of imazethapyrdegrading bacterium.

Key words Imazethapyr；Degrading bacteria；HPLC；Identification

除草剂咪草烟因具杀草谱广、活性高、选择性强等特点，是我国大豆产区用于杂草防治的重要农药。咪草烟在土壤中半衰期长，自然降解缓慢[1]，随着使用年限的增加，残留咪草烟会污染农田土壤，对后茬敏感作物产生药害，并导致大豆田轮作困难。此外，残留咪草烟还可通过雨水渗透，对农田周围水源造成污染，经食物链富集，亦可对人和其他哺乳动物的健康构成潜在危害[2]。目前全国大豆每年种植面积近700万hm2，其中黑龙江省大豆种植面积约占全国的60%，因而咪草烟使用量巨大。鉴于此，笔者分离并鉴定了对咪草烟具有降解作用的高效乡土菌株，以期填补该领域的空白并为后续田间实际应用和产业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基。

基础培养基：硝酸铵1.00 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g，硫酸铵0.50 g，磷酸二氢钾0.50 g，酵母膏0.05 g，磷酸氢二钾1.50 g，水1 L，pH 7.0。

富集培养基：蛋白胨10.0 g，氯化钠1.00 g，磷酸氢二钾1.00 g，水1 L，葡萄糖1.00 g，pH 7.0。

Tonomura无碳培養基：硫酸铵1.00 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.50 g，磷酸氢二钾1.50 g，硝酸钠1.00 g，氯化钙0.05 g，硫酸亚铁0.02 g，水1 L。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.00 g，蛋白胨10.00 g，琼脂20.00 g，氯化钠5.00 g，水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.2 药剂与试剂。

500 ml 5%咪草烟水剂（豆施乐）；咪草烟原药（纯度99.99%）；DV810A细菌DNA提取试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]；Quick Taq HS DyeMix PCR试剂（广东广州美津生物技术有限公司）；溶菌酶（100 mg/L）Rnase。

1.2 方法

1.2.1 土样的采集。

采用生物学统计法[3]。在黑龙江省哈尔滨市郊区的大豆和玉米田地进行多点随机取样，共采取土样5份，用无菌聚乙烯膜袋保存样品，在-4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的分离和驯化。

分别称取待测土样10.00 g，经 105 ℃ 烘干 8 min，置于干燥器中，待冷却后称质量，计算土壤含水量。称取相当于 10.00 g 干土的湿土，加入盛有 90 ml富集培养基的250 ml三角瓶中，加咪草烟至100 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min摇床培养24 h。移取培养液10 ml接入90 ml新鲜富集培养基，提高咪草烟至200 mg/L，置于 30 ℃、180 r/min摇床培养24 h。上述步骤循环操作[4]，直至咪草烟浓度为500 mg/L。将培养液接入分离培养基（咪草烟浓度为500 mg/L，无碳源），继续培养7 d，之后用基础培养基，每隔7 d移种1次，咪草烟浓度仍为500 mg/L，14 d后再将富集所得菌液用平板划线纯化[5]，保存对咪草烟有降解作用的细菌。

1.2.3 菌株对咪草烟降解率的测定。

用接种针挑取初筛出的保存于斜面的各培养菌种，加10 ml无菌水，轻刮斜面制成菌悬液，分别接种到已知除草剂浓度为500 mg/L的30 ml Tonomura无碳培养基中。以不加任何菌株的 Tonomura无碳-咪草烟培养基作为空白对照，30 ℃恒温摇床黑暗振荡培养3 d后，再静置培养10 min，得纯培养液[6]。

量取纯培养液10 ml于无菌离心管中，10 000 r/min离心5 min，取上清液，加入250 ml分液漏斗中，同时向分液漏斗中加入上清液2倍体积的二氯甲烷，剧烈振荡10 min，加入氯化钠至饱和，再剧烈振荡2 min，室温下静置，使有机相与水相分离，重复2次，合并有机相经无水硫酸钠干燥后，收集到250 ml圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上35 ℃浓缩近干，然后在常温下吹干，用色谱甲醇定容至2 ml，待测[7]。

1.2.4 高效液相色谱检测条件。

色谱柱：250 mm涂有ZORBAX SBC18的不锈钢柱，内径4.6 mm；检测波长254 nm；流速0.9 ml/min；柱温40 ℃；进样量20 μl；流动相为甲醇的醋酸水溶液，甲醇∶水∶冰乙酸=38∶58∶4（V/V/V），保留时间约为8.54 min。采用Agilent1100液相色谱仪，配紫外检测器（VWD，色谱工作站）[8]。

1.2.5 高效降解菌的基因组DNA提取及系统发育分析。

1.2.5.1 基因组DNA提取。采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒对高效菌株进行DNA提取。

1.2.5.2 琼脂糖胶电泳。对提取的DNA进行凝胶电泳，以便确定是否成功提取得到DNA以及DNA的纯度是否达到要求[9]。

1.2.5.3 PCR扩增。对目的DNA进行PCR扩增，以提高纯度方便测序。采用Quick Taq HS DyeMix作为PCR试剂，该产品为预混了DNA polymerase（Taq DNA Polymerase）、PCR反应用Buffer、dNTP Mixture的2×预混PCR试剂。将其分装到离心管中，加入模板DNA和引物，即可进行PCR扩增。PCR反应体系体积为50 μl[10]，引物为细菌16S通用引物，27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT。

电泳检测扩增产物，若产物纯度达标，将PCR产物送公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

以500 mg/L的咪草烟浓度驯化14 d后，筛选到3种革兰氏阳性细菌菌株： CX白、CX红、CX黄，在培养基上外观分别呈现白色、红色和黄色。

2.2 降解率的测定

由表1可知，菌株CX黄、CX红、CX白对甲胺磷的平均降解效率分别达到 13.19%、38.82%和58.98%，其中CX白效果最好。

2.3 高效降解菌CX白的基因组DNA提取及系统发育分析 由图1和图2可知，MCY1是降解咪草烟的高效菌株CX白，与Bacillus属的megaterium种最接近，可信度为98%。据此可初步鉴定，试验组分离得到的咪草烟高效降解菌是革兰氏阳性的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）细菌。

3 讨论

试验结果表明，在黑龙江省本土确实存在能够降解除草剂咪草烟的高效菌株，因此，在黑龙江省应用微生物降解除草剂咪草烟具有一定的可行性，为除草剂降解找到一条可实践的新途径。该菌株进入田间实际应用，将会极大地消除田间残留农药对环境及农作物生长的不良影响，在一定程度上提高农作物产量，并减小农药残留对人畜健康和安全的潜在影响。

参考文献

[1] 刘维屏，郑巍.除草剂咪草烟在土壤上吸附-脱附过程及作用机理[J].土壤学报，1998，35（4）：475-481.

[2] 何丽莲，李元.农田土壤农药污染的综合治理[J].云南农业大学学报，2003，18（4）： 430-434.

[3] 齐文虎，谢高地，丁贤忠.精准农业土壤采样密度研究——以上海精准农业试验示范基地为例[J].中国生态农业学报，2003，11（1）：48-52.

[4] 沈东升，方程冉，周旭辉.土壤中降解甲磺隆除草剂的微生物的分离与筛选[J].上海交通大学学报：农业科学版，2002，20（3）： 186-189.

[5] 向万胜，吴金水.土壤微生物的分离，提取与纯化研究进展[J].应用生态学报，2003，14（3）： 453-456.

[6] 張浩，王岩.反相高效液相色谱法检测土壤中的咪草烟[J].农业环境保护，2001，20（4）：264-265.

[7] 周艳明，张寒松，赵瑛博，等.反相高效液相色谱法检测大豆中咪草烟[J].食品科学，2010（8）：237-240.

[8] 才绍玉.高效液相色谱法测定咪·三氟水剂中咪草烟和三氟羧草醚的含量[J].化学工程师，2003（4）：31-32.

[9] 赵勇，周志华，李武，等.土壤微生物分子生态学研究中总 DNA 的提取[J].农业环境科学学报，2006，24（5）： 854-860.

[10] 张桂山，贾小明，马晓航，等.一株多菌灵降解细菌的分离，鉴定及系统发育分析[J].微生物学报，2004，44（4）： 417-421.