禽流感不同检测方法对比

李玉莹

流感是一种历史悠久的疾病，人类历史上曾经多次流行并引起严重的后果，例如1918-1919年西班牙流感流行、1957-1958年始于中国贵州进而蔓延全球的流感疫情。到了1997年香港发生人感染H5N1禽流感事件，造成150万只鸡被宰杀，6人死亡；2003年亚洲地区H5N1禽流感爆发，人禽均出现死亡病例；2009年H1N1流感大流行，疫情席卷全球持续了一年多，出现疫情的国家和地区达到了214个，造成约1.85万人死亡；2013年H7N9型禽流感在上海和安徽两地率先发现，造成全国37人死亡。由资料可见，近几年禽流感疫情发生频率逐渐频繁、流行范围广、破坏力强，文章比较禽流感不同检测方法，旨在阐明各种检测方法优、劣势及适用范围，力争做到早发现、早确诊、早治疗，把危害降到最低。

疾病检测首先要了解病原体特性，进而选择特异性和敏感性的试验方法。禽流感是由A型禽流感病毒引起的家禽和人类急性接触性疾病，近年来以H5N1和H7N9发病次数多、致病力强，发病率和死亡率较高。禽流感病毒为正粘病毒科流感病毒属、单链RNA、电镜下外观呈球形或多形态、直径80～120 nm、有包膜、包膜上有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）两种糖蛋白突起为主要抗原成份。但HA和NA亚型众多，而且各亚型或血清型之间无交叉反应性，这使得禽流感病毒的检测工作较为困难。任何一种疾病检测均分为病原学检测和血清学检测两种方法，禽流感病原学检测方法主要为电镜直接观察法和培养法，血清学常用检测方法主要分为琼脂扩散实验、酶免实验、金标快速实验、免疫荧光实验等。

1 病原学检测

1.1 电镜直接观察法

取疑似感染的标本，以病毒分布较多的呼吸道及肺部取材，将标本处理后在电镜下直观观察，根据禽流感病毒自身的形态、结构等不同特征，能很快做出诊断。但电镜观察结果与样本制备技术、病料采集的部位和时间、检测人员技术有关，且电镜法不能用于亚型及致病性的测定，因此该技术可用于科研方面，临床检测应用较少。

1.2 培养法

病毒分离培养法是禽流感诊断的“金标准”，也可用于免疫禽群的监测手段。禽流感病毒培养实验分为细胞培养法和鸡胚培养法。细胞培养一般使用MDCK细胞，采用标本预处理、细胞接种、细胞病变观察的过程，大多数病毒株的复制高峰约在感染后72 h。鸡胚培养法一般选取9～11日龄SPF鸡胚，疑似样本加入双抗研磨后离心取上清液，尿囊腔接种标本，24~120 h培养病毒。死亡鸡胚尿囊液中若检测出有凝血活性，可进一步确定分型。该方法特异性和敏感性较高，但操作相对繁琐、检测时间长、需要一周左右时间，因此不能用于常规快速检测。

2 血清学检测

2.1 琼脂扩散实验

琼脂扩散实验是利用可用性抗原和抗体在半固体琼脂板中相向扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。由于所有的禽流感病毒都具有型特异性共同抗原，可用一种AIV的抗原或抗血清对所有AIV的抗体或抗原（目前有15种血凝素亚型）进行鉴定。取疑似感染禽流感10 d左右的血清，与已知的禽流感抗原作琼脂扩散试验，如出现阳性反应，即可确诊禽流感病毒感染。该方法缺点是时间过长,敏感不高，且不能区分动物血清抗体阳性是病毒感染所致还是计划免疫所产生的抗体。

2.2 酶免实验

酶联免疫吸附试验(Ezyme linked immunosor-bentassay, ELISA)是一种经典的检测方法，通过辣根过氧化物酶标记抗原或抗体、在微孔板进行抗原抗体结合、通过底物显色反应判断结果，分为捕获法、间接法、夹心法等，并可实现定性和定量，是检测A型禽流感病毒和血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速的诊断技术，已成为AI流行病学及早期快速诊断的最有效和实用的方法。有研究表明ELISA方法相比较琼脂扩散实验、血凝实验、补体结合实验具备较高的敏感性。随着检测技术的不断发展，已由早期的捕获法、间接法发展到最近的夹心法。包被禽流感抗原、加入待检标本、再加入酶标记抗原的双抗原夹心法可用于禽流感特异性抗体的检测，Watcharatanyatip 等建立了双抗原夹心ELISA 来检测A型流感病毒的抗体，以重组的A型流感病毒核蛋白作为捕获抗原，而辣根过氧化物酶标记的抗原来检测抗体，在运用该方法对125 份血清样品的检测中，敏感性和特异性分别为98%和97.3%，该方法能够在接种后第4 天从感染鸭子中检测出H5N1 亚型抗体，但此方法不能区分是自然感染还是免疫接种后产生的抗体。包被纯化的禽流感病毒抗体、加入待检标本、再加入酶标记抗体的双抗体夹心法可用于禽流感抗原的检测。肖云才等[1] 采用纯化的H9N2亚型病毒免疫鸡获得了鸡抗AIV 抗血清，由于在全病毒抗原中，具有型特异性的核蛋白抗原( NP) 、基质抗原(M ) 占了全病毒抗原的80%以上，亚型抗原只占整个抗原成分的16%左右，因此， 用鸡抗禽流感高免血清作包被抗体，能查出所有A 型流感病毒。所以, 本试剂盒能查出所有亚型的AIV 感染，但不能确定是哪一种亚型。

2.3 金标快速实验

胶体金技术是20世纪80年代发展起来的固相标记免疫测定技术，将抗原或单克隆抗体固定在层析介质上、以胶体金为标记物、应用免疫层析的原理,对抗原或抗体进行检测。2006年蔡家利等[2]利用胶体金标记抗AIV单克隆抗体和羊抗AIV抗体建立了一种简便、快速、准确的检测动物禽流感病毒(AIV)的胶体金免疫层析法试剂盒，灵敏度可达10 ng/mL，与进口禽流感胶体金免疫层析试剂条比较,符合率达100%。2008年艾嘉亮[3]以胶体金颗粒标记针对M蛋白单克隆抗体,以多克隆抗体(禽流感病毒的羊血清)作为检测线捕获抗体建立了检测通用型禽流感病毒的双抗体夹心胶体金免疫层析方法。5 min可出结果，和其他禽类病毒没有明显的交叉反应性。免疫胶体金试纸条检测禽流感可以现场操作，直接取喉气管棉拭子进行检测，无须仪器设备，操作简单，可广泛用于流感病毒的早期诊断。缺点是对禽流感检测的敏感性较低(10 ng/mL) ,容易漏检或假阳性,不易定量,不方便大批量的集约操作。

2.4 免疫荧光实验

免疫荧光实验是利用荧光素作为标记物，荧光素标记的抗原(或抗体)特异性地与抗体(或抗原)结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应来进行观察。IFA包括直接荧光抗体法和间接荧光抗体法，后者较常用。IFA 最早应用荧光标记禽流感病毒核糖蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗体检测组织触片中的禽流感病毒。2008年白泉阳等[4]以鸡抗禽流感抗体和兔抗鸡荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)，结果于细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。该方法具有快速、简便、敏感性高等特点，但由于标本前处理较为复杂，且需要特殊的荧光显微镜和有经验的实验操作人员，临床应用较少。■（编辑：狄慧）

参考文献：

[1] 肖运才,毕丁仁,李自力,等.禽流感病毒夹心ELISA 诊断试剂盒的研制及应用[J].中国兽医学报, 2005,25(6):570-572.

[2] 蔡家利,吴胜昔, 胡仁建,等.胶体金免疫层析法快速诊断禽流感[J].重庆工学院学报, 2006(11):4-7.

[3] 艾嘉亮.通用型禽流感病毒胶体金免疫层析诊断方法的建立[D].哈尔滨:东北农业大学.2008.

[4] 白泉阳,孙颖杰,郑腾,等.H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较[J].福建农业学报,2008(2):146-148.